Кафедра ФБРтаБ Фізіологія, біохімія рослин та біоенергетика · НУБіП України
Бета-версія
Лабораторна робота № 2

Вплив температури і pH на активність ферментів

Чому «температурний оптимум» залежить від тривалості досліду і як заряди амінокислот активного центру визначають pH-оптимум.

БіохіміяФерменти≈ 90 хвилин

01Мета і план

Мета

Дослідити залежність активності ферментів від температури та pH середовища, навчитися визначати енергію активації, Q10, температурний і pH-оптимуми.

Ви навчитеся

  • будувати графік Арреніуса;
  • відрізняти каталіз від інактивації;
  • пов'язувати pH-профіль із pKa груп активного центру.

Знадобиться

Калькулятор або Excel, міліметровий папір чи бланк звіту.

02Теоретичні відомості

Температура прискорює каталіз…

Швидкість хімічної реакції зростає з температурою, бо більша частка молекул має енергію, достатню для подолання активаційного бар'єра. Константу швидкості каталітичної стадії описує рівняння Арреніуса:

k=A·e−Ea/(RT)⇔lnk=lnA−EaR·1T (1)

Ea — енергія активації, Дж/моль; R = 8,314 Дж/(моль·К); T — абсолютна температура, К. На графіку Арреніуса (ln k від 1/T) отримуємо пряму з нахилом −Ea/R.

У фізіології рослин частіше користуються температурним коефіцієнтом Q10 — у скільки разів зростає швидкість за нагрівання на 10 °C. Для ферментативних реакцій Q10 ≈ 1,5–3:

Q10=kT+10kT=exp(10EaRT(T+10)) (2)

…але руйнує білок

Одночасно з нагріванням прискорюється теплова денатурація — розгортання поліпептидного ланцюга. Її можна описати як реакцію першого порядку з дуже високою енергією активації Ed (200–500 кДж/моль), тому інактивація «вмикається» різко у вузькому інтервалі температур:

dEактdt=−kdEакт,kd=ln210хв·exp[−EdR(1T−1Td)] (3)

Td — температура, за якої половина ферменту інактивується за 10 хв.

Якщо активність вимірюють за кількістю продукту, накопиченого за час досліду τ, то середня швидкість дорівнює:

v‾(T)=k(T)·1−e−kdτkdτ (4)

Температурний оптимум — не константа ферменту: що довше триває дослід, то більше встигає інактивуватися фермент і то нижчим виявляється оптимум. Перевірте це в моделі, змінюючи τ.

pH і стан іонізації активного центру

Каталіз часто потребує, щоб одна група активного центру була протонована (напр., –COOH аспартату чи глутамату), а інша — депротонована (напр., імідазол гістидину). Нехай фермент існує у трьох формах: EH2+ ⇌ EH ⇌ E−, з яких активна лише EH. Тоді:

v=Vmax1+10pK1−pH+10pH−pK2,pHопт=pK1+pK22 (5)

Крива має дзвоноподібну форму; якщо pK1 і pK2 відрізняються більш ніж на 2–3 одиниці, точки, де активність дорівнює половині максимальної, наближено збігаються з pK1 і pK2. За значеннями pKa можна припустити, які амінокислоти беруть участь у каталізі: Asp/Glu ≈ 3,5–4,5; His ≈ 6–7; Cys ≈ 8–8,5; Lys ≈ 10–10,5.

Рослинні ферменти мають pH-оптимуми, пов'язані з їхньою локалізацією: кислі гідролази вакуолі (pH ≈ 5), ферменти цитозолю (pH ≈ 7,2–7,5), ферменти строми хлоропластів, активні на світлі, коли pH строми зростає до ≈ 8 (Рубіско, фруктозо-1,6-бісфосфатаза).

03Модель: температура

Фермент

Відносна активність від температури

Графік Арреніуса

Уявний оптимум
—
Q10 (20→30 °C)
—
t½ ферменту при Tопт
—
Активного ферменту після досліду при Tопт
—

04Модель: pH

Фермент

Значення pKa для пресетів — наближені, для навчальної моделі.

Відносна активність від pH

Частки форм ферменту

pH-оптимум
—
Максимальна частка EH
—
Інтервал ≥ 50 % активності
—

05Віртуальний експеримент

Ви досліджуєте фермент, виділений з проростків. Активність визначають за кількістю продукту, утвореного за фіксований час інкубації. Виміряйте активність за різних температур (pH 7) і за різних pH (25 °C).

Ваш варіант

Прізвище або номер у журналі.

06Завдання для звіту

  1. У моделі температури встановіть тривалість досліду 2 хв, потім 60 хв. Як змінився уявний оптимум? Поясніть результат за допомогою рівнянь (3)–(4).
  2. Порівняйте ферменти з Ea = 30 і 70 кДж/моль: розрахуйте Q10 за формулою (2) і перевірте за моделлю.
  3. За даними експерименту побудуйте графік Арреніуса (ln v від 1/T, T у кельвінах) лише для температур, де інактивація незначна (10–40 °C). Методом найменших квадратів знайдіть нахил і обчисліть Ea = −нахил·R.
  4. Розрахуйте Q10 як відношення активностей при 20 і 10 °C. Визначте температурний оптимум (як температуру з найвищою виміряною активністю або за інтерполяцією).
  5. За pH-профілем визначте pH-оптимум та pH, за яких активність становить 50 % від максимальної. Які амінокислоти можуть брати участь у каталізі?

07Контрольні питання

Чому після певної температури активність ферменту різко падає?
Енергія активації денатурації значно більша за енергію активації каталізу, тому швидкість інактивації зростає з температурою набагато крутіше і в певний момент «переважає» прискорення каталізу.
Чому температурний оптимум залежить від тривалості досліду?
За довшої інкубації фермент встигає частково денатурувати навіть за помірно високих температур, тож середня виміряна активність знижується, і максимум зсувається до нижчих температур.
Що таке Q10 і як він пов'язаний з енергією активації?
Відношення швидкостей реакції при температурах, що відрізняються на 10 °C; Q10 = exp[10·Ea/(R·T·(T+10))], тож більша Ea означає більший Q10.
Чому pH-профіль активності часто має форму дзвона?
Активна лише одна форма іонізації ферменту (EH): у кислому середовищі переважає протонована неактивна форма EH2+, у лужному — депротонована E−.
Чому активність Рубіско та інших ферментів циклу Кальвіна зростає на світлі?
На світлі протони закачуються з строми в люмен тилакоїдів, pH строми зростає до ≈ 8, а концентрація Mg2+ підвищується — умови, оптимальні для цих ферментів.

08Література

  1. Daniel R. M., Danson M. J. A new understanding of how temperature affects the catalytic activity of enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 2010. Vol. 35, № 10. P. 584–591.
  2. Peterson M. E., Daniel R. M., Danson M. J., Eisenthal R. The dependence of enzyme activity on temperature: determination and validation of parameters. Biochemical Journal. 2007. Vol. 402. P. 331–337.
  3. Taiz L., Zeiger E., Møller I. M., Murphy A. Plant Physiology and Development. 6th ed. Sunderland : Sinauer Associates, 2015.
  4. Cornish-Bowden A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. 4th ed. Wiley-Blackwell, 2012. Ch. 10.
← ЛР 1. Кінетика ферментів ЛР 3. Амінокислоти →