Кафедра ФБРтаБ Фізіологія, біохімія рослин та біоенергетика · НУБіП України
Бета-версія
Лабораторна робота № 1

Кінетика ферментативних реакцій

Як швидкість реакції залежить від концентрації субстрату, що означають Km і Vmax і як інгібітори змінюють роботу ферменту.

БіохіміяФерменти≈ 90 хвилин

01Мета і план

Мета

Опанувати кількісний опис ферментативного каталізу, навчитися визначати кінетичні параметри ферменту та тип інгібування за експериментальними даними.

Ви навчитеся

  • будувати криву Міхаеліса–Ментен і лінеаризації;
  • знаходити Km, Vmax, Ki;
  • розрізняти типи інгібування.

Знадобиться

Браузер, калькулятор або Excel (дані експортуються у CSV), бланк звіту.

02Теоретичні відомості

Ферменти — біологічні каталізатори білкової природи, які прискорюють реакції в мільйони разів, не змінюючи їхньої рівноваги. Фермент E оборотно зв'язує субстрат S в активному центрі, утворюючи фермент-субстратний комплекс ES, який перетворюється на продукт P:

E+S⇌k1,k−1ES→kcatE+P

Якщо концентрація ES швидко досягає стаціонарного рівня (наближення Бріггса–Голдейна, 1925), початкова швидкість реакції описується рівнянням Міхаеліса–Ментен:

v=Vmax[S]Km+[S],Km=k−1+kcatk1,Vmax=kcat[E]0 (1)
  • Vmax — максимальна швидкість, коли всі молекули ферменту насичені субстратом; пропорційна кількості ферменту.
  • Km (константа Міхаеліса) — концентрація субстрату, за якої v = Vmax/2. Що менша Km, то вища спорідненість ферменту до субстрату.
  • kcat/Km — каталітична ефективність (константа специфічності).

За малих [S] ≪ Km реакція має перший порядок за субстратом (v ≈ Vmax[S]/Km), за великих [S] ≫ Km — нульовий (v ≈ Vmax).

Лінеаризації

Історично параметри знаходили, перетворюючи гіперболу (1) на пряму. Обернення обох частин дає рівняння Лайнуівера–Берка (подвійних обернених величин):

1v=KmVmax·1[S]+1Vmax (2)

Пряма перетинає вісь ординат у точці 1/Vmax, вісь абсцис — у точці −1/Km; тангенс кута нахилу дорівнює Km/Vmax.

Рівняння Іді–Хофсті менш чутливе до похибок за малих [S]:

v=Vmax−Km·v[S] (3)

Обернення «розтягує» похибки найменш точних вимірювань за малих [S], тому оцінки з графіка Лайнуівера–Берка зміщені. Сучасний стандарт — нелінійна регресія безпосередньо за рівнянням (1). У віртуальному експерименті порівняйте обидва підходи.

Оборотне інгібування

Інгібітор I може зв'язуватися з вільним ферментом (константа дисоціації Ki) та/або з комплексом ES (Ki′). Загальне рівняння змішаного інгібування:

v=Vmax[S]αKm+α′[S],α=1+[I]Ki,α′=1+[I]Ki′ (4)
Тип інгібуванняЗв'язуєKmуявнаVmaxуявнаГрафік Л–Б
КонкурентнеEαKm ↑не змінюєтьсяпрямі перетинаються на осі 1/v
Неконкурентне (Ki = Ki′)E і ESне змінюєтьсяVmax/α ↓перетин на осі 1/[S]
БезконкурентнеESKm/α′ ↓Vmax/α′ ↓паралельні прямі
ЗмішанеE і ESαKm/α′Vmax/α′ ↓перетин у II квадранті

Приклади з біохімії рослин. Гербіцид гліфосат конкурує з фосфоенолпіруватом за активний центр 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS) і блокує синтез ароматичних амінокислот. Іони важких металів (Pb²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺) зв'язують SH-групи ферментів поза активним центром, що здебільшого проявляється як неконкурентне інгібування. Малонат — класичний конкурентний інгібітор сукцинатдегідрогенази циклу Кребса.

Кінетична крива

Під час реакції субстрат витрачається, тому швидкість поступово падає. Зміну [S] у часі описує диференціальне рівняння, яке модель розв'язує чисельно методом Рунге–Кутти 4-го порядку:

d[S]dt=−Vmax[S]Km+[S],[P]=[S]0−[S] (5)

Саме тому в експерименті вимірюють початкову швидкість — тангенс кута нахилу кривої [P](t) при t → 0.

03Інтерактивна модель

Змінюйте параметри ферменту та інгібітора. Суцільна лінія — реакція з інгібітором, пунктир — без нього. Наведіть курсор на графік, щоб побачити значення.

Фермент

Інгібітор

Km уявна
—
Vmax уявна
—
v при [S] = Km
—
Ступінь інгібування
—

04Віртуальний експеримент

Ви отримали препарат «невідомого» ферменту з листків пшениці та розчин інгібітора. Виміряйте початкові швидкості реакції за різних концентрацій субстрату без інгібітора і в його присутності. Кожне вимірювання містить випадкову похибку ≈ 4 %, як у реальному досліді.

Ваш варіант

Введіть прізвище або номер у журналі — дані будуть індивідуальними й відтворюваними.

05Завдання для звіту

  1. За допомогою моделі побудуйте криві Міхаеліса–Ментен для двох ферментів з однаковою Vmax та Km, що відрізняється в 10 разів. Який фермент ефективніше працює за низьких концентрацій субстрату? Поясніть.
  2. Для кожного типу інгібування замалюйте (або збережіть) графік Лайнуівера–Берка та сформулюйте, за якими ознаками його можна розпізнати.
  3. Проведіть віртуальний експеримент за своїм варіантом. Заповніть таблицю: [S], v0, vI, 1/[S], 1/v0, 1/vI.
    • Побудуйте графік Лайнуівера–Берка, знайдіть рівняння прямих методом найменших квадратів (Excel: функція ЛИНЕЙН).
    • Обчисліть Km, Vmax та уявні параметри в присутності інгібітора.
  4. Визначте тип інгібування і розрахуйте Ki за формулами таблиці з розділу 2. Перевірте відповідь у формі вище.
  5. Оцініть Km і Vmax ще й за графіком Іді–Хофсті або нелінійною регресією (Excel: «Пошук рішення»). Порівняйте результати і зробіть висновок про точність методів.
  6. У режимі «Кінетична крива» визначте, за який час розпадеться 50 % субстрату при [S]0 = Km та [S]0 = 10·Km. Чому ці часи не пропорційні [S]0?

06Контрольні питання

Який фізичний зміст константи Міхаеліса? Чи завжди Km дорівнює константі дисоціації комплексу ES?
Km — концентрація субстрату, за якої швидкість дорівнює половині максимальної. Вона збігається з KS = k−1/k1 лише коли kcat ≪ k−1 (рівноважне наближення Міхаеліса–Ментен).
Чому для визначення кінетичних параметрів вимірюють саме початкову швидкість реакції?
На початку реакції концентрація субстрату відома (дорівнює [S]0), продукт ще не накопичився і не інгібує фермент, а зворотна реакція несуттєва.
Як відрізнити конкурентне інгібування від неконкурентного за графіком Лайнуівера–Берка?
За конкурентного прямі перетинаються на осі ординат (Vmax незмінна), за неконкурентного — на осі абсцис (Km незмінна).
Чому конкурентне інгібування можна подолати надлишком субстрату, а неконкурентне — ні?
Конкурентний інгібітор і субстрат змагаються за той самий центр: за великої [S] частка ферменту, зв'язаного з інгібітором, прямує до нуля. Неконкурентний інгібітор зв'язується і з ES, тож частина ферменту залишається неактивною за будь-якої [S].
Що таке каталітична ефективність і яке її максимально можливе значення?
kcat/Km; її обмежує частота дифузійних зіткнень ферменту із субстратом — близько 108–109 М−1·с−1 («каталітично досконалі» ферменти, напр. каталаза, тріозофосфатізомераза).

07Література

  1. Nelson D. L., Cox M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 8th ed. New York : W. H. Freeman, 2021. Ch. 6.
  2. Cornish-Bowden A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. 4th ed. Weinheim : Wiley-Blackwell, 2012.
  3. Johnson K. A., Goody R. S. The original Michaelis constant: translation of the 1913 Michaelis–Menten paper. Biochemistry. 2011. Vol. 50, № 39. P. 8264–8269.
  4. Briggs G. E., Haldane J. B. S. A note on the kinetics of enzyme action. Biochemical Journal. 1925. Vol. 19, № 2. P. 338–339.
← Усі роботи ЛР 2. Температура і pH →