Розділ лабораторії

Фізіологія рослин

Інтерактивні математичні моделі до 12 лабораторних робіт з дисципліни «Фізіологія рослин з основами біохімії». Оберіть роботу зі списку нижче: у кожній — теорія, інтерактивна модель і контрольні питання. Першою в списку — модель «Вплив фітогормонів».

МОДЕЛЬ

Вплив фітогормонів: корінь, пагін чи калус

Як співвідношення ауксину й цитокініну в живильному середовищі визначає, що виросте з експланта: правило Скуга–Міллера, карта морфогенезу та ріст культури за шість тижнів.

ауксинцитокінінкалус

ЛР1

Плазмоліз, деплазмоліз і потенційний осмотичний тиск клітин цибулі

Осмос і тургор, гіпер- та гіпотонічні розчини, стадії плазмолізу; визначення ізотонічної концентрації та осмотичного тиску клітинного соку за формулою Вант-Гоффа.

Вант-Гоффосмос

ЛР2

Проникність живого і мертвого протопласту для клітинного соку

Вихід беталаїнів з клітин буряка під дією температури, кислот, спирту й окисників; кінетика виходу пігменту і колір розчину зі спектра.

кінетика виходу пігменту

ЛР3

Визначення життєздатності насіння за фарбуванням цитоплазми (за Л. О. Івановим)

Метод фарбування цитоплазми за Івановим: живі зародки не пропускають барвник; розрахунок життєздатності та довірчий інтервал для вибірки.

біноміальна вибірка

ЛР4

Вивчення стану продихового апарату рослин

Будова й рух продихів, транспірація як дифузія; методи Шталя, Моліша і відбитків; провідність продихів і вплив світла, CO₂, вологості.

закон Фікапровідність

ЛР5

Фізичні та хімічні властивості пігментів

Хлорофіли й каротиноїди: спектри поглинання, розділення за Краусом, омилення, феофітинізація, заміщення магнію та флуоресценція.

Бер–Ламбертколір зі спектра

ЛР6

Розподіл пігментів методом одномірної паперової хроматографії

Розділення пігментів на папері: коефіцієнт рухомості Rf, рух фронту розчинника, розмиття плям і порядок пігментів на хроматограмі.

RfЛукас–Вошберн

ЛР7

Фотосенсибілізуюча дія хлорофілу на реакцію перенесення водню (за О. А. Гуревичем)

Реакція Красновського: хлорофіл на світлі переносить електрони від аскорбінової кислоти до метилового червоного; фотокінетика і контрольні варіанти.

фотокінетика Красновського

ЛР8

Виявлення активності ферментів пероксидази і каталази у рослинному матеріалі

Виявлення каталази за піною кисню та пероксидази за окисненням субстрату; кінетика Міхаеліса–Ментен і вплив температури.

Міхаеліс–МентенАрреніус

ЛР9

Мікрохімічний аналіз золи рослин

Виявлення K, Ca, Mg, P, S, Fe, Cl у золі за формою кристалів; дифузія іонів, пересичення і нуклеація: чому кристали великі чи дрібні.

дифузіянуклеаціяKsp

ЛР10

Виявлення нітратів у рослинному матеріалі

Дифеніламінова проба на нітрати, шкала балів, накопичення нітратів у рослинах і зменшення їхнього вмісту при вимочуванні та варінні.

дифузія з пластини (Кранк)

ЛР11

Періодичність росту деревних рослин

Велика крива росту Сакса, довжина міжвузлів як похідна логістичної кривої; обробка власних вимірювань пагона.

логістикакрива Сакса

ЛР12

Визначення жаростійкості рослин (за Ф. П. Мацковим)

Метод Мацкова: побуріння листків після прогрівання і обробки HCl; кінетика теплового ушкодження за Арреніусом і порівняння видів.

Арреніускумулятивне ушкодження

Інтерактивна модель

Вплив фітогормонів: корінь, пагін чи калус

правило Скуга–Міллера: ауксин / цитокінін → корінь · калус · пагін

Як співвідношення ауксину й цитокініну в живильному середовищі визначає, що виросте з експланта за шість тижнів. Коротка теорія, потім інтерактивна модель.

Частина I

Теорія

Фітогормони

Фітогормони — сигнальні речовини, які рослина синтезує сама і які діють у дуже малих концентраціях (10⁻⁹–10⁻⁵ моль/л). Спеціалізованих залоз немає: гормон може утворити майже будь-яка клітина, а ефект залежить від концентрації, тканини й інших гормонів поруч.

Класичні групи: ауксини, цитокініни, гібереліни, абсцизова кислота, етилен (пізніше — брасиностероїди, жасмонати, саліцилова кислота, стриголактони). У культурі тканин головні перші дві: саме їхнє співвідношення в середовищі визначає, які органи утворить експлант.

Перерахунок одиниць

c_мкМ = c_мг/л · 1000 / M

1 мг/л НОК: ≈ 5,37 мкМ (M = 186,2)
1 мг/л БАП: ≈ 4,44 мкМ (M = 225,3)
1 мг/л ІОК: ≈ 5,71 мкМ (M = 175,2)

Ауксини

Перша відкрита група (Ч. і Ф. Дарвіни, 1880; Ф. Вент, 1928). Головний природний ауксин — індоліл-3-оцтова кислота (ІОК), утворюється з триптофану в меристемах пагонів, молодих листках і насінні. Має полярний транспорт (білки PIN, AUX1/LAX) від верхівки до основи, тому накопичується в базі живця — там і утворюються корені.

розтягнення клітин (кислотний ріст клітинної стінки);
закладання бічних і придаткових коренів (ризогенез);
апікальне домінування, тропізми, диференціація провідних тканин;
in vitro у високих концентраціях — дедиференціація і калус.

Як клітина «чує» ауксин

ауксин+TIR1/AFB→руйнування Aux/IAA→ARF→гени

Ауксин — «молекулярний клей» між рецептором і репресором, який потім руйнується. Мають зруйнуватися кілька репресорів, тому відповідь тканини різка й нелінійна.

Речовина	Тип	Застосування in vitro	M, г/моль
ІОК (IAA)	природний	0,1–3 мг/л; нестійка (світло, автоклав, ферменти)	175,2
ІМК (IBA)	природний	Укорінення мікропагонів і живців, 0,1–2 мг/л	203,2
НОК (NAA)	синтетичний	Укорінення і калус, 0,05–2 мг/л; стійкий. Використано в моделі	186,2
2,4-Д	синтетичний	Калус, соматичний ембріогенез, 0,1–5 мг/л; у високих дозах — гербіцид	221,0
Піклорам	синтетичний	Ембріогенні культури злаків і хвойних, 0,1–5 мг/л	241,5

Цитокініни

Відкриті як фактор поділу клітин тютюну: кінетин (К. Міллер, Ф. Скуг, 1955), перший природний — зеатин (Д. Летам, 1963). Більшість — похідні аденіну (зеатин, 2iP, БАП, кінетин); окрема група — похідні фенілсечовини (тидіазурон). Синтезуються переважно в кінчиках коренів і йдуть ксилемою в пагін.

разом з ауксином запускають поділ клітин;
індукують і підтримують ріст пагонів (каулогенез);
знімають апікальне домінування — на БАП утворюється «кущ» пагонів;
затримують старіння листків, але гальмують укорінення.

Як клітина «чує» цитокінін

цитокінін+AHK2/3/4→AHP→ARR типу B→гени

Двокомпонентна система, як у бактерій: фосфатна естафета від мембрани до ядра. ARR типу A створюють негативний зворотний зв'язок.

Речовина	Тип	Застосування in vitro	M, г/моль
транс-Зеатин	природний	0,1–5 мг/л; дуже активний, дорогий	219,2
2iP	природний	1–10 мг/л; рододендрони, лохина, орхідеї	203,2
БАП (6-БА)	синтетичний	Мультиплікація пагонів, 0,5–5 мг/л; дешевий, стабільний. Використано в моделі	225,3
Кінетин	синтетичний	0,1–5 мг/л, калусні культури	215,2
Тидіазурон (TDZ)	синтетичний	0,001–1 мг/л; регенерація деревних і бобових	220,3

Правило Скуга–Міллера

Ф. Скуг і К. Міллер (1957) показали на калусі тютюну: тип органогенезу визначає не кількість кожного гормону, а їхнє співвідношення.

високе ауксин : цитокінін (≈ 10 : 1 і вище) → корені;
низьке (≈ 1 : 10 і нижче) → пагони;
проміжне за високих концентрацій обох → калус;
обох мало → експлант майже не реагує.

Гормони гальмують сигнальні шляхи одне одного, тому невеликий зсув балансу перемикає програму розвитку. На практиці: мультиплікація на БАП, укорінення — на ІМК чи НОК без цитокініну.

Співвідношення ауксин : цитокінін

Пагони≈ 1 : 10 і нижче

Калусобидва високі

Корені≈ 10 : 1 і вище

← більше цитокінінубільше ауксину →

На карті морфогенезу в моделі межі зон ідуть уздовж діагоналей — ліній сталого співвідношення.

Основні терміни

In vitro: вирощування клітин і тканин поза організмом у стерильних посудинах.
Експлант: фрагмент рослини, введений у культуру (у моделі — сегмент стебла).
Живильне середовище: солі, вітаміни, сахароза 2–3 %, фітогормони, агар 0,6–0,8 % (найчастіше МС, 1962).
Тотипотентність: здатність соматичної клітини дати цілу рослину.
Дедиференціація: втрата клітиною спеціалізації й повернення до поділу.
Калус: неорганізована маса клітин на зрізі експланта; потребує ауксину й цитокініну.
Органогенез: утворення органів: прямий — з експланта, непрямий — через калус.
Ризогенез / каулогенез: утворення коренів (ауксин) / пагонів (цитокінін).
Мікроклональне розмноження: введення в культуру → мультиплікація → укорінення → адаптація ex vitro.
Апікальне домінування: гальмування бічних бруньок верхівковою через ауксин; цитокінін його знімає.
Гіпергідричність: склоподібні, ламкі пагони від надлишку цитокініну (у моделі — БАП > ≈ 3 мг/л).
Пасаж: перенесення на свіже середовище через 3–6 тижнів; модель охоплює 42 доби.

Чому ауксин буває токсичним

Ауксин потрібен, щоб закласти корінь, але в надлишку гальмує його ріст, а у великих дозах убиває тканини (2,4-Д — гербіцид).

Різна чутливість органів: корені реагують на концентрації в тисячі разів нижчі, ніж стебла.
Етилен: високий ауксин вмикає АЦК-синтазу; етилен робить корені короткими й товстими.
Калус замість коренів: хаотичні поділи замість організованої меристеми.
НОК і 2,4-Д майже не руйнуються ферментами і накопичуються; зростає оксидативний стрес.

У моделі це враховує множник токсичності з порогом K_T: біля нього індукція коренів падає, а корені стають коротшими й товщими.

Схема за К. Тиманном (1937): відповідь кореня, бруньки і стебла на ауксин. Вище нуля — стимуляція, нижче — гальмування; затінено діапазон 0,01–10 мг/л НОК.

Параметри моделі

Значення якісні: підібрані так, щоб відтворити класичні результати. Параметри з ★ можна змінювати в моделі («Параметри моделі»).

Символ	Назва	Значення	Зміст
A	Концентрація ауксину (НОК)	0,01–10 мг/л	Керована змінна; логарифмічна шкала
C	Концентрація цитокініну (БАП)	0,01–10 мг/л	Керована змінна
R, S, X	Біомаса коренів, пагонів, калусу	0,01 K	Початковий запас компетентних клітин експланта
K	Ємність середовища	1 (≈ 1,5 г)	Ресурси однієї посудини; спільні для трьох тканин
μ_R, μ_S, μ_X ★	Макс. швидкості росту	0,35 · 0,30 · 0,22 доба⁻¹	Подвоєння ≈ 2 · 2,3 · 3,2 доби; калус росте лише поділом
n ★	Коефіцієнт Гілла	2	Крутизна відповіді: 10 → 90 % при зміні концентрації у 9 разів
K_A^R ★	Поріг ауксину для коренів	0,3 мг/л	Ризогенез дуже чутливий до ауксину
K_C^R ★	Гальмування коренів цитокініном	0,15 мг/л	Навіть сліди БАП заважають укоріненню
K_T ★	Поріг токсичності ауксину	4 мг/л	Вище ≈ 6 мг/л корені майже не ростуть
K_C^S, K_A^S ★	Пагони: поріг БАП / гальмування ауксином	0,3 · 0,3 мг/л	Тому в середовищах мультиплікації ауксину мало
K_A^X, K_C^X ★	Калус: пороги ауксину / цитокініну	1 · 0,3 мг/л	Калус потребує обох гормонів; ауксину — більше, ніж корені
t	Час культивування	0–42 доби	Один пасаж; метод Ейлера, крок 0,1 доби

Частина II

Інтерактивна модель

Змінюйте концентрації гормонів повзунками, кнопками готових середовищ або клацанням по карті морфогенезу. Натисніть «Пуск», щоб переглянути ріст культури з першої доби.

Склад середовища

Ауксин (НОК)

Цитокінін (БАП)

Ауксин : цитокінін

Типові середовища

Тривалість культивування

Параметри моделі

Зміст кожного параметра пояснено в розділі 7.

Культуральна посудина

Корені, шт.

Найдовший корінь

Пагони, шт.

Висота пагона

Калус, ⌀

Сира маса, мг

Індукційні функції f(A, C)

Ризогенез

Каулогенез

Калусогенез

Карта морфогенезу

Колір показує домінантну програму для кожної пари концентрацій, насиченість — її силу. Пунктири — лінії сталого співвідношення. Клацніть або проведіть по карті, щоб змінити склад середовища; з клавіатури — стрілками.

кореніпагоникалус

Динаміка біомаси

Частка ємності середовища, яку займає кожна тканина. Ресурси спільні, тож домінантна програма витісняє інші. Вертикальна лінія — поточна доба.

корені Rпагони Sкалус X

Література

Skoog F., Miller C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro // Symposia of the Society for Experimental Biology. 1957. Vol. 11. P. 118–130.
Miller C. O., Skoog F., Von Saltza M. H., Strong F. M. Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid // Journal of the American Chemical Society. 1955. Vol. 77. P. 1392.
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15. P. 473–497.
Thimann K. V. On the nature of inhibitions caused by auxin // American Journal of Botany. 1937. Vol. 24. P. 407–412.
Hill A. V. The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves // Journal of Physiology. 1910. Vol. 40. P. iv–vii.
Müller B., Sheen J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis // Nature. 2008. Vol. 453. P. 1094–1097.
Taiz L., Zeiger E., Møller I. M., Murphy A. Plant Physiology and Development. 6th ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2015.
Кушнір Г. П., Сарнацька В. В. Мікроклональне розмноження рослин: теорія і практика. Київ: Наукова думка, 2005.