Транспорт іонів у клітинах рослин

Плазмалему утворює подвійний шар фосфоліпідів: гідрофільні головки дивляться у воду (цитозоль і апопласт), гідрофобні хвости утворюють неполярне ядро завтовшки кілька нанометрів. Тому чистий бішар пропускає речовини дуже вибірково:

Отже, бішар — це електричний ізолятор між двома провідниками (розчинами з рухливими іонами). Єдині «шлюзи» для іонів — інтегральні білки: канали, транспортери (переносники) та помпи (АТФази). Саме їхня регуляція задає іонний склад цитозолю, тургор і pH, від яких залежать конформація білків і робота нуклеїнових кислот.

Усі іонні канали — від бактерій до людини — мають трансмембранний домен, що утворює пору, і регуляторні домени з сайтами для агоністів, блокаторів, алостеричних модуляторів і протеїнкіназ (класичний приклад багатосайтової регуляції — нікотиновий ацетилхоліновий рецептор).

Мембранний потенціал — різниця електричних потенціалів між внутрішньою і зовнішньою поверхнями мембрани. Потенціал зовнішнього розчину приймають за нуль:

Для потенціалу не потрібна макроскопічна зміна концентрацій — досить мікроскопічного надлишку нескомпенсованих зарядів уздовж поверхонь «ліпідного конденсатора». Жива клітина завжди заряджена мінусом усередині; потенціал 0 мВ — ознака мертвої клітини.

Струм іонів через мембрану підкоряється закону Ома: I = ΔV / R = g · ΔV, де провідність g = 1/R (у сименсах) пропорційна кількості відкритих каналів.

Уявімо посудину з мембраною. Якщо в мембрані є пори для сахарози, вона дифундує, доки концентрації не зрівняються. А якщо внести KCl, а канали пропускають лише K⁺? Калій піде за хімічним градієнтом, хлорид залишиться — лівий відсік зарядиться негативно, правий позитивно, і електричне поле почне тягнути K⁺ назад. Настане рівновага двох сил.

Потенціал реверсії (рівноважний, нернстівський) E_i — потенціал, за якого електрична сила точно врівноважує дифузійну, і результуючий потік іона дорівнює нулю. Іони й далі проходять відкритими каналами в обидва боки, але входжень стільки ж, скільки виходжень. E_i залежить лише від співвідношення концентрацій, заряду іона і температури — і не залежить від кількості відкритих каналів.

Формула (1.3) — для 21 °C. R = 8,314 Дж/(моль·К); T — температура, К; z — заряд іона зі знаком (+1 для K⁺ і Na⁺, +2 для Ca²⁺, −1 для Cl⁻ і NO₃⁻); F = 96 485 Кл/моль.

Сумарний струм іона визначають провідність мембрани для нього і електрохімічна рушійна сила (V_m − E_i):

Якщо V_m = E_i, струму немає навіть за повністю відкритих каналів.

Транспорт поділяють за термодинамікою (пасивний — за електрохімічним градієнтом; активний — проти нього, за рахунок АТФ або градієнта іншого іона) і за механізмом білка:

За стехіометрією транспортери бувають трьох типів:

Активний транспорт на прикладі конформаційних циклів

1. Вторинно-активний: H⁺/лактозний симпортерЗовні багато H⁺. Протон зв'язується з Glu транспортера → утворюється високоафінний сайт для лактози → білок повертається в цитозоль, де спорідненість падає: лактоза виходить проти свого градієнта, слідом — H⁺. Жоден субстрат не переноситься без іншого.
2. Первинно-активний: Ca²⁺-АТФаза P-типуСтан E₁: високоафінні сайти Ca²⁺ дивляться в цитозоль. Зв'язування Ca²⁺ і АТФ, гідроліз, фосфорилювання аспартату → стан E₂-P: пора відкрита назовні, спорідненість падає, Ca²⁺ виходить проти 10 000-кратного градієнта. Відщеплення Pᵢ повертає E₁.

Як калієвий канал пропускає K⁺ (радіус ≈ 1,33 Å) майже зі швидкістю вільної дифузії, але блокує менший Na⁺ (≈ 0,95 Å) з селективністю понад 1000 : 1? Відповідь дала кристалічна структура бактеріального каналу KcsA зі Streptomyces lividans (Doyle et al., 1998; Нобелівська премія Р. МакКіннона 2003 р.).

• Консервативний мотив у P-петлі всіх K⁺-каналів — від бактерій і Arabidopsis до людини: T-V-G-Y-G (або споріднений GYGD).
• «Молекулярна рукавичка»: карбонільні кисні остова TVGYG усіх чотирьох субодиниць дивляться в пору і замінюють іону молекули води.
• Чому не Na⁺: геометрія кисневої «клітки» точно підігнана під дегідратований K⁺. Менший Na⁺ дістає лише 1–2 кисні — втрату гідратної оболонки нічим компенсувати, тож вхід у фільтр невигідний.

KcsA       Streptomyces (бактерія) … T V G Y G D …
KAT1, AKT1 Arabidopsis (рослина)    … T V G Y G D …
Shaker     Drosophila (комаха)     … T V G Y G D …
Kv1.2      людина                  … T V G Y G D …

За механізмом «воріт» (gating) канали бувають:

Струм через мембрану залежить і від провідності g, і від потенціалу V_m — якщо потенціал «плаває», ці ефекти не розділити. Тому вимірюють у режимі фіксації потенціалу.

1. Voltage clampЕлектрод вимірює V_m; підсилювач порівнює його з командним V_cmd і миттєво інжектує компенсуючий струм, що утримує V_m = V_cmd. Цей струм дорівнює (з протилежним знаком) сумарному іонному струму мембрани.
2. Patch clamp (Е. Неєр, Б. Сакман)Скляна мікропіпетка з кінчиком 0,1–0,2 мкм, заповнена електролітом з Ag/AgCl-електродом; опір у розчині 10–40 МОм. Піпетки витягують на пулері перед дослідом.
3. ПротопластиКлітинна стінка не пускає піпетку до плазмалеми, тому її розщеплюють целюлазами й пектиназами в гіперосмотичному середовищі (або виділяють вакуолі для вивчення тонопласта).
4. Гігаомний контакт (gigaseal)Легке підсмоктування — і між склом та бішаром виникає контакт з опором 1–10 ГОм. Без нього струм одного каналу (кілька пА) «витік» би в щілину й потонув у шумі.

Ємність мембрани і площа протопласта

Еквівалентна схема: опір піпетки R_s, опір контакту R_seal, опір мембрани R_m і ємність мембрани C_m. Бішар — тонкий діелектрик між двома провідниками, тобто плаский конденсатор ≈ 1 мкФ/см². На сходинку потенціалу спершу тече ємнісний струм I_c = C_m·dV/dt; його інтеграл дає площу протопласта і дозволяє нормувати струм у пА/пФ.

Поодинокі канали, макрострум і I–V криві

• Дискретність: запис одного каналу — прямокутні сходинки між «закрито» і «відкрито»; напіввідкритих станів немає. Кілька каналів у патчі дають кратні сходинки 1i, 2i, 3i (Hedrich & Neher, 1987).
• P_open: кожен канал відкривається випадково, але сума ~300 записів відтворює макроскопічний струм цілої клітини разом з активацією та інактивацією.
• Потенціал-залежність струму ≠ потенціал-залежність воріт. Струм будь-якого відкритого каналу залежить від напруги за законом Ома, і I–V крива — пряма через E_rev. Потенціал-залежний канал (як KAT1) має ворота, закриті при деполяризації, і нелінійну «випрямляючу» I–V криву.
• Хвостові струми (tail currents): після повернення потенціалу канали закриваються не миттєво — спадаючий «хвіст» показує кінетику деактивації і дозволяє точно виміряти E_rev.

Як довести, що струм несе конкретний білок

Почнемо з практикуму: як читати електрофізіологічні графіки в статтях.

Patch clamp інвазивний: потрібні протопласти, і не видно розподілу потенціалу по живій тканині. Альтернатива — оптичні методи з флуоресцентними зондами.

Після клонування GFP медузи Aequorea victoria (О. Сімомура) і створення палітри EBFP, ECFP, EGFP, EYFP, mCherry (Р. Тсієн) з кінця 1990-х з'явилися три родини генетично кодованих індикаторів потенціалу (GEVI):

Коли трансформація неможлива (пилкові трубки ялини Picea abies чи лілії Lilium longiflorum), використовують синтетичні барвники.

Помпи й транспортери працюють у 10⁴–10⁵ разів повільніше за канали, а частина обмінів електронейтральна — у патчі їхній струм не виміряти. Класичне рішення — суспензія ізольованих везикул плазмалеми чи тонопласта.

• Регуляція кіназою PKS5: у мутанта pks5 ISO-везикули закислюються швидше, ніж у Col-0, а з конститутивно активною кіназою — повільніше. Отже, PKS5 фосфорилює та гальмує H⁺-АТФазу (Fuglsang et al., 2007).
• Ca²⁺/H⁺-антипортер: після закислення додають CaCl₂ — сигнал повертається (залужнення), бо CAX обмінює внутрішні H⁺ на Ca²⁺; швидкість лінійно росте з [Ca²⁺] до ~40 мкМ.

Калій — головний неорганічний катіон рослинної клітини: до 10 % сухої маси. Він не входить до ковалентних сполук, але виконує незамінні функції:

У цитоплазмі [K⁺] тримається на рівні 100–200 мМ, а в ґрунтовому розчині часто лише 10–200 мкМ — у тисячу разів менше. За концепцією Епштейна корінь поглинає калій двома системами:

У геномі Arabidopsis thaliana близько 71 гена транспорту K⁺ і неселективних катіонних каналів:

Функціональний канал Shaker — гомо- або гетеротетрамер: чотири α-субодиниці оточують K⁺-селективну пору. Натисніть на частини субодиниці:

За філогенією та реакцією на гіпер- чи деполяризацію 9 каналів Shaker поділяють на п'ять груп:

Чому вхідні канали рослин активуються гіперполяризацією

У нейронах K⁺-канали переважно вихідні: вони повертають потенціал до спокою після потенціалу дії. Рослинна ж плазмалема постійно гіперполяризована H⁺-АТФазами до −120…−200 мВ. Якщо зовні 100 мкМ K⁺, а всередині 100 мМ, пасивний вхід можливий лише тоді, коли V_m негативніший за E_K. Канал, що відкривався б при −40 мВ, не поглинав би, а випускав калій у ґрунт за тисячократним градієнтом. Тому AKT1 і KAT1 налаштовані відкриватися лише при сильнішій гіперполяризації, а AtKC1 додатково страхує від витоку.

Окрім потенціалу, канали Shaker тонко регулюються pH (підкислення гальмує групу V, але активує KAT1), поліамінами, білками 14-3-3, Ca²⁺ і фосфорилюванням.

1. Низький K⁺ зовні → кальцієвий сигналУ клітинах епідермісу й кори кореня зростає [Ca²⁺]_cyt.
2. CBL1 / CBL9 → CIPK23Кальцієві сенсори CBL1 і CBL9 (calcineurin B-like) рекрутують до плазмалеми кіназу CIPK23 і активують її.
3. CIPK23 → AKT1Кіназа зв'язується з анкіриновим доменом AKT1 і фосфорилює канал. В ооцитах Xenopus сам AKT1 майже не дає струму — струм з'являється лише з CBL1 (або CBL9) + CIPK23 (Xu et al., 2006; Li et al., 2006).
4. Сайти Ser26 і Ser338Специфічні для AKT1 серини: на N-кінці та в C-лінкері (їх немає в KAT1 і SKOR). Заміна S→A на обох (S26A/S338A), як і S338A, майже скасовує активацію; S26A суттєво знижує струм.

AKT2 і CBL4–CIPK6. На відміну від AKT1, комплекс CBL4 (SOS3) – CIPK6 підвищує калієву провідність флоеми не фосфорилюванням воріт, а посиленням доставки каналу AKT2 з ЕР на плазмалему (Held et al., 2011).

Друга родина K⁺-каналів — тандем-порові канали (TPK, раніше KCO).

• Еволюційний парадокс. Канали прокаріотів були потенціал-залежними; у вищих рослин TPK стали практично потенціал-незалежними — вони відкриваються при будь-якому потенціалі, якщо Ca²⁺ зв'язався з EF-hand і приєднався 14-3-3.
• AtTPK1 (тонопласт). Поодинокі пА-струми слабко залежать від напруги, але потребують мікромолярного цитозольного Ca²⁺. У замикаючих клітинах TPK1 швидко випускає K⁺ з вакуолі при АБК-індукованому закриванні продихів; у tpk1 закривання уповільнене (Gobert et al., 2007).
• AtTPK3 (тилакоїди). Регулює фотосинтез (Carraretto et al., 2013): виводить K⁺ із люмена в строму, розряджаючи електричну складову ΔΨ і перетворюючи протонно-рушійну силу на ΔpH — потрібний для синтезу АТФ і нефотохімічного гасіння (NPQ).

Родина HKT (High-affinity K⁺ Transporters) споріднена з бактеріальними TrkH/KtrB і грибними Trk. Один білок — це чотири повтори M1–P–M2 (8 трансмембранних спіралей, 4 пори P_A–P_D), що згортаються навколо центральної пори.

Парадокс мутанта hkt1 (sas2)

Здавалося б: якщо HKT1;1 впускає токсичний Na⁺, мутант має бути стійкішим. Насправді на 50 мМ NaCl мутант hkt1 (sodium overaccumulation in shoots 2, Berthomieu et al., 2003) гине від хлорозу швидше за дикий тип.

Рис. У рисі OsHKT2;1 при дефіциті K⁺ поглинає Na⁺ як «замінник осмоліту», майже не проводячи K⁺, а OsHKT2;2 солестійкого сорту Pokkali в культурі клітин тютюну BY-2 поглинає Rb⁺/K⁺ лише в присутності Na⁺ — класичний Na⁺/K⁺-симпортер (Horie et al., 2001).

Родич Arabidopsis — галофіт Thellungiella salsuginea (Eutrema salsugineum) — витримує 300–500 мМ NaCl (Ali et al., 2012; Ali et al., 2016).

1. Дуплікація генаГен HKT1 тандемно подвоївся, і паралог TsHKT1;2 зберігає поглинання K⁺ навіть при надлишку Na⁺.
2. Одна амінокислотаУ порі P_B, де в глікофітів (AtHKT1;1) стоїть незаряджений аспарагін N211, у TsHKT1;2 — негативний аспартат D207. Це відновлює канонічний «калієвий» мотив, як аспартат у KcsA.
3. Перевірка в ArabidopsisМутант hkt1-1, трансформований TsHKT1;2 або власним AtHKT1;1-N211D (заміна в позиції 242 ефекту не мала), стає солестійким: більше K⁺, менше Na⁺.
4. Перевірка в ооцитахN211D різко зменшує вхідний Na⁺-струм і перетворює Na⁺-уніпортер на транспортер із вираженою провідністю для K⁺ — спробуйте в моделі вище.

Родина KT/HAK/KUP відсутня у тварин, але є в бактерій (KUP), грибів (HAK) і всіх рослин (13 генів в Arabidopsis). Це великі білки з 10–14 трансмембранними доменами, що працюють як K⁺/H⁺-симпортери — саме вони поглинають калій при < 10 мкМ, коли канал AKT1 уже безсилий.

Як вмикається HAK5 при калієвому голодуванні

1. ГіперполяризаціяПри падінні K⁺ нижче 10–20 мкМ плазмалема епідермісу кореня миттєво гіперполяризується.
2. RBOH → АФКГіперполяризація активує НАДФН-оксидази RBOHD/RBOHC, що генерують H₂O₂.
3. Ca²⁺ → RAP2.11 → ген HAK5АФК відкривають Ca²⁺-канали; кальцієва сигнатура індукує транскрипційний фактор RAP2.11, який сідає на промотор HAK5.
4. CBL–CIPK23 → білок HAK5Сенсори CBL1, CBL8, CBL9, CBL10 активують CIPK23, яка фосфорилює N-кінець HAK5 і переводить його у високоактивний стан (Ragel et al., 2015).

Несподівані функції білків KUP

У хлоропластах Arabidopsis працюють три K⁺/H⁺-антипортери родини KEA (Kunz et al., 2014):

Підсумкова часова схема подій у клітині кореня після різкого падіння K⁺ у ґрунті:

1. секундиГіперполяризація плазмалемиE_K стає значно негативнішим
2. хвилиниRBOHD → H₂O₂позаклітинні та цитоплазматичні АФК
3. хв — десятки хвПідйом [Ca²⁺]_cytАФК і гіперполяризація відкривають Ca²⁺-канали
4. посттрансляційноCBL1/9–CIPK23активує AKT1 (з AtKC1 проти витоку) і HAK5
5. транскрипціяRAP2.11 → HAK5при < 10 мкМ увесь потік K⁺ бере на себе HAK5

Кальцій у рослині виконує дві ролі: структурну (зшиває пектини клітинної стінки, стабілізує мембрани) і сигнальну — універсальний вторинний месенджер, що регулює канали, кінази, екзоцитоз і цитоскелет.

Ca²⁺ легко осаджується з фосфатом — основою енергетики клітини (АТФ). Тому вільний Ca²⁺ у цитозолі тримається на рівні ~100 нМ, а в депо — на 4–5 порядків вище:

Кальцієва сигнатура

Ультрафіолет, тепло і холод, посуха, засолення, важкі метали, дотик, поранення, H₂O₂, ауксин, АБК, еліситори патогенів — майже все підвищує [Ca²⁺]_cyt. Клітина розрізняє стимули за сигнатурою: амплітуда, тривалість, частота осциляцій, лаг-фаза, локалізація. Її розшифровують декодери — кальмодуліни (CaM), CML, кінази CDPK/CPK, комплекси CBL–CIPK.

Для чіткої сигнатури видалення Ca²⁺ проти градієнта не менш важливе, ніж вхід: високоафінні Ca²⁺-АТФази P-типу (ACA — автоінгібовані кальмодулін-регульовані, ECA — типу ЕР), низькоафінні високоємні Ca²⁺/H⁺-антипортери CAX, буферні білки й ліпіди.

У тварин збудливі клітини використовують потенціал-залежні Ca²⁺-селективні канали Ca_V. Після секвенування геному Arabidopsis виявилося: у наземних рослин гомологів Ca_V немає зовсім. Кальцієву провідність забезпечують неселективні або помірно селективні катіонні канали.

Субодиниця CNGC має 6 трансмембранних сегментів і P-петлю між S5 і S6 — топологія як у Shaker, але пора неселективна: Ca²⁺, K⁺, Na⁺. У C-кінці — CNBD (цАМФ або цГМФ відкривають канал) і IQ-домен / CaMBD для кальмодуліну, що дає кальцій-залежний зворотний зв'язок.

Як «бачать» Ca²⁺: FRET-сенсор Yellow Cameleon 3.6

CNGC14: ауксин, Ca²⁺ і гравітропізм (Shih et al., 2015)

1. Секунди після ауксинуЗадовго до змін транскрипції: стрімкий підйом Ca²⁺ (YC3.6) і залужнення поверхні кореня (гальмується H⁺-АТФаза).
2. Два незалежні алеліcngc14-1 і cngc14-2: при Т-ДНК мутагенезі можливі фонові інсерції, тож лише однаковий фенотип двох алелей доводить роль саме цього гена.
3. СпецифічністьУ мутантів зникає і Ca²⁺-пік, і залужнення на ауксин, а відповідь на позаклітинний АТФ збережена.
4. ГравітропізмПоворот проростка на 90°: ауксин на нижньому боці → через 5 хв Ca²⁺ і pH ↑ → клітини нижнього боку гальмують ріст → корінь гнеться вниз. У cngc14 асиметричного сигналу немає, вигин затриманий, хоча амілопласти-статоліти нормальні.

GLR (20 генів в Arabidopsis) — гомологи іонотропних глутаматних рецепторів синапсів хребетних (AMPA/каїнатних, NMDA). Субодиниця: позаклітинний N-кінцевий домен, ліганд-зв'язуючий домен (LBD) для глутамату, гліцину, серину, цистеїну, три трансмембранні M1–M3 і P-петля. Тетрамер з високою проникністю для Ca²⁺.

Розбір статтіGLR потрібні для хемотаксису сперматозоїдів мохуOrtiz-Ramírez et al., 2017, Nature

У квіткових 20 генів GLR дублюють один одного, тож автори взяли мох Physcomitrium patens, де лише 2 гени (PpGLR1, PpGLR2).

• Patch clamp протопластів протонеми й експресія в клітинах COS-7: PpGLR1 — Ca²⁺-проникний канал плазмалеми, струм зростає з Ca²⁺ і блокується DNQX/CNQX.
• У ppglr1;ppglr2 дводжгутикові сперматозоїди пливуть з нормальною швидкістю, але не знаходять вхід в архегоній і не індукують BELL1, потрібний для розвитку зиготи.

Розбір статтіГлутамат запускає далеку кальцієву сигналізацію при пораненніToyota et al., 2018, Science

Гусінь кусає листок №1 — і за 40–120 с у віддаленому листку №6 спалахує хвиля Ca²⁺, що запускає синтез жасмонатів.

• Візуалізація: біолюмінесценція екворину (апоекворин + целентеразин, у повній темряві) і флуоресцентний GCaMP3 — видно, як хвиля йде провідними пучками.
• Механізм: зруйновані клітини вивільняють L-глутамат в апопласт; крапля 100 мМ глутамату на кінчик листка відтворює хвилю. У glr3.3;glr3.6 (GLR3.3 — флоема, GLR3.6 — ксилемна паренхіма) системна хвиля і електричний сигнал зникають.

TPC1 — єдиний ген в Arabidopsis, відповідає за класичний повільний вакуолярний (SV) струм (Peiter et al., 2005). Функціональний канал — гомодимер; кожен мономер — два Shaker-подібні 6-TM домени (S1–S12, пори P1 і P2) з власними сенсорами напруги, а між ними — два мотиви EF-hand. Канал проводить K⁺, Na⁺, Ca²⁺; відкривається, коли цитозольний Ca²⁺ сідає на EF-hand, а високий вакуолярний Ca²⁺ його гальмує.

Найвідоміші швидкі механореакції — венерина мухоловка (Dionaea muscipula) і мімоза сором'язлива (Mimosa pudica): потенціали дії й скидання тургору в моторних клітинах. Але механочутливість — властивість кожної клітини рослини:

Ключові експерименти

Плазмалема заряджена мінусом усередині (−120…−180 мВ), а аніони (Cl⁻, NO₃⁻, малат²⁻) накопичуються в цитоплазмі до мілімолярних концентрацій симпортом з H⁺. Тому електрохімічний градієнт для всіх аніонів спрямований назовні. Відкриття аніонних каналів одразу дає:

У 1989–1992 рр. лабораторії Дж. Шредера і К. Рашке методом patch clamp знайшли в протопластах замикаючих клітин два типи аніонних струмів (Schroeder & Hagiwara, 1989; Linder & Raschke, 1992):

Як знайшли SLAC1: тепловізор

Двадцять років S-струм був «безіменним». Ген знайшли одночасно дві групи (Vahisalu et al., 2008; Negi et al., 2008). Відкриті продихи випаровують воду й охолоджують листок; при CO₂, посусі, озоні чи АБК продихи закриваються — і листок нагрівається. Інфрачервона камера виявила мутанти slac1, листки яких лишалися холодними: продихи не могли закритися. SLAC1-GFP — на плазмалемі замикаючих клітин; у slac1 повністю зник S-струм, а R-струм і Ca²⁺-струми лишилися.

Мережа сигналів, що відкриває SLAC1

1. Кальцій-незалежна гілка АБКБез стресу фосфатази PP2C (ABI1, ABI2, HAB1) тримають OST1 і SLAC1 дефосфорильованими. АБК + рецептори PYR/PYL/RCAR блокують ABI1 → вільна OST1 фосфорилює SLAC1 (Ser120).
2. Кальцій-залежна гілкаCa²⁺ активує CPK6, CPK21, CPK23 і той самий модуль CBL1/9–CIPK23, що регулює AKT1 і NRT1.1; вони фосфорилюють SLAC1 і SLAH3 (напр., Ser59).
3. CO₂ і бікарбонатβ-карбоангідрази βCA1/βCA4 перетворюють CO₂ на HCO₃⁻. Бікарбонат може діяти на трансмембранний домен SLAC1 (без N- чи C-кінця канал не реагує на АБК, але частково — на CO₂) і через RHC1 (або MPK4/MPK12) гальмує кіназу HT1 — негативний регулятор, що при низькому CO₂ тримає продихи відкритими. «Інгібування інгібітора» знімає блок з OST1/GHR1.

Родина CLC є і в тварин, і в рослин (7 генів AtClC-a…g). У людини мутації CLC викликають тяжкі каналопатії:

У рослин усі CLC — на внутрішніх мембранах: AtClC-a, -b, -c, -g — тонопласт; AtClC-d, -f — Гольджі і TGN (разом з V-АТФазою регулюють pH люмена); AtClC-e — тилакоїди.

У замикаючих клітинах AtClC-a закачує NO₃⁻ у вакуолю при відкриванні продихів, а при дії АБК кіназа OST1 фосфорилює її N-кінець — і обмін змінюється на вихід аніонів з вакуолі; у clca реакція продихів на АБК порушена (Wege et al., 2014).

Назва родини ALMT (14 генів) — від першого гена стійкості до алюмінію в пшениці (TaALMT1, Sasaki et al., 2004).

Головна форма азоту в аеробних ґрунтах — нітрат (NO₃⁻). Плазмалема заряджена негативно, а в клітині нітрату часто більше, ніж у ґрунті, тому поглинання — активний симпорт 2H⁺ : 1NO₃⁻ за рахунок протонно-рушійної сили H⁺-АТФази.

CHL1 / AtNRT1.1 / NPF6.3 — перший клонований еукаріотичний транспортер нітрату (І-Фан Цай і Дж. Шредер, Tsay et al., 1993). Мутант chl1 стійкий до гербіциду хлорату, бо не поглинає його разом з нітратом.

У Arabidopsis 7 генів NRT2: поглинання з ґрунту — NRT2.1, 2.2, 2.4, 2.5; NRT2.7 — на тонопласті дозріваючого насіння. Як корінь у «голодній» зоні повідомляє решту рослини, що треба посилити поглинання? (Ohkubo et al., 2017; 2021)

Карта транспортерів нітрату в цілій рослині

Фосфор рослини беруть лише як ортофосфат (Pᵢ: H₂PO₄⁻ / HPO₄²⁻). У ґрунті його 1–10 мкМ, у цитоплазмі — 5–10 мМ. Надлишок добрив виснажує запаси фосфоритів і спричиняє евтрофікацію водойм.

1. Доказ H⁺/Pᵢ-симпортуДодавання Pᵢ до кореня: Pᵢ зникає з розчину, зовнішній pH росте, цитозоль тимчасово підкислюється, плазмалема деполяризується — електрогенний симпорт 2–4 H⁺ : 1 H₂PO₄⁻.
2. Функціональна комплементація дріжджівШтам Δpho84 (без власного високоафінного транспортера) гине на низькому фосфаті. Бібліотека кДНК з коренів «голодного» Arabidopsis → трансформація → виживають лише колонії з робочим рослинним геном: так клоновано PHT1;1 і PHT1;4 (Muchhal et al., 1996).

П'ять рівнів регуляції PHT1

Активний транспорт усіх розглянутих іонів спирається на три родини АТФаз: P-типу (ковалентний фосфорильований інтермедіат), V-типу (роторні вакуолярні помпи) і F-типу (АТФ-синтази мітохондрій і хлоропластів).

H⁺-АТФаза плазмалеми AHA2

У рослин замість Na⁺/K⁺-АТФази головна помпа — H⁺-АТФаза підродини P_IIIA (AHA1–AHA11, домінують AHA1 і AHA2), незворотно гальмується ортованадатом. Кристалічна структура AHA2 (Pedersen et al., 2007): мембранний домен M1–M10 (протон зв'язує Asp684, Asn106 — «заслінка» проти зворотного потоку), цитоплазматичні N (АТФ), P (фосфорилюється Asp329) і A (дефосфорилювання і «поршень»), і автоінгібіторний C-кінцевий R-домен.

Ca²⁺-АТФази ACA

Ca²⁺–CaM сідає на N-кінець ACA і знімає автоінгібування (CDPK додатково фосфорилюють Ser22). Саме швидкість вмикання й відкачування ACA задає гостроту і частоту кальцієвих піків. AtACA9 на плазмалемі пилкових трубок потрібна для верхівкових осциляцій Ca²⁺, росту трубки і запліднення (Schiøtt et al., 2004).

V-АТФаза

Редокс-регуляція: H₂O₂, NO, малеїмід і окиснений глутатіон гальмують V-АТФазу (як і H⁺-АТФазу плазмалеми), окиснюючи чи нітрозилюючи цистеїни субодиниці A; відновники і H₂S повертають активність.