Молекулярна генетика рослин

Про дисципліну. Молекулярна генетика розвитку рослин — інтегральна дисципліна на стику генетики, молекулярної біології, фізіології та анатомії рослин. Вона пояснює, як формуються морфологічні й анатомічні ознаки рослини і які молекулярні механізми за цим стоять. Для опанування корисні знання з генетики, молекулярної біології, анатомії та фізіології рослин.

Історія назви Arabidopsis thaliana.

• Рослина непоказна, настільки непомітна, що навіть не має народної назви (хоча росте й на території Східної Європи).
• 1577 р. — лікар Йоганн Таль знайшов її в горах Гарц (Німеччина) і описав як Pilosella siliquosa («пухнаста стручкова»: опушене листя + плоди-стручки). Це ще донаукова, добінарна номенклатура.
• 1753 р. — Карл Лінней перейменував рослину на Arabis thaliana (резуха Таля) на честь першовідкривача.
• 1842 р. — під час ревізії роду Arabis Густав Гейнгольд (G. Heynhold) виділив рід Arabidopsis; повна назва — Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (у дужках — автор першого опису, далі — автор нової комбінації).

Систематичне положення. Покритонасінні → дводольні → порядок Капустоцвіті (Brassicales) → родина Капустяні / Хрестоцвіті (Brassicaceae). Рід невеликий — близько 11 видів.

Екологія. Арабідопсис — ефемер: заселяє місця з порушеним трав'яним покривом, де вегетаційний період дуже короткий (рання весна чи пізня осінь). За короткий час рослина проходить повний цикл до насіння, а далі насіння перечікує несприятливий період у ґрунті.

Вимоги до «рослинної дрозофіли» і відповідність їм арабідопсису:

Історія становлення моделі.

• 1943 р. — у Німеччині Фрідріх Лайбах обґрунтував придатність арабідопсису як модельного об'єкта.
• Георг (Джордж) Редеї (угорського походження) зібрав колекцію європейських рас; 1956–1957 рр. виїхав до США, де працював в аграрному університеті в Колумбії (штат Міссурі), викладав курс бур'янів, а арабідопсис вирощував у теплиці «як хобі», відбирав і схрещував раси, накопичив цінну колекцію мутантів. Коли до арабідопсису прийшла популярність, дослідник уже захворів на хворобу Альцгеймера.
• Маартен Корнеф (M. Koornneef), Нідерланди: 1982 р. захистив дисертацію з арабідопсису, багато працював із мутагенезом, побудував першу генетичну карту (76 ознак/маркерів). Його колекція мутантів — одна з основних у світі.

Основні раси (екотипи) арабідопсису.

• Columbia (Col) — відібрана в США (Колумбія, Міссурі) з колекції Редеї; найпопулярніший «дикий тип», його геном секвеновано першим.
• Landsberg (Ler, Landsberg erecta) — низькоросла компактна раса; несе мутацію erecta (карликовість), тому її не можна вважати «чистим» диким типом — під час аналізу мутацій треба враховувати взаємодію з цим фоном.
• Wassilewskija (Ws) — ще одна широко використовувана лабораторна раса.
• Cape Verde Islands (Cvi) — з островів Зеленого Мису.
• Dijon (Di) — з околиць Діжона (Франція; поля Міністерства сільського господарства, регіон гірчиці).

Ареал. Сучасний ареал — від Канади й Норвегії на півночі (є «озимі» раси, що проростають восени й цвітуть навесні) до пустель і гір Середньої Азії. Рослина поширюється з людиною (дороги, частинки ґрунту на взутті, шинах тощо) — фактично синантропний бур'ян.

Незручності моделі. Багато мутантів стерильні, а вегетативно зберегти мутацію важко: однорічник після плодоношення гине (програмована загибель). Тому для порівняння використовують споріднені види:

• Arabis (резуха) — багаторічники; можна вегетативно розмножувати мутантів; порівняння з однорічним арабідопсисом допомагає знайти гени багаторічності, перезимівлі тощо.
• Thellungiella halophila (= Eutrema) — галофіт солончаків; модель для пошуку генів солестійкості (арабідопсис солі не витримує).
• Промислові хрестоцвіті: ріпак (головна олійна культура помірного поясу; результати з арабідопсису легко переносяться на ріпак для створення ГМ-сортів), капуста (генна інженерія в її селекції майже не застосовується, але арабідопсис слугує референсом).

Рослинна клітина має три геноми:

Одиниці: пара нуклеотидів (bp), кілобаза (kb = 10³ bp), мегабаза (Mb = 10⁶), гігабаза (Gb = 10⁹).

Порівняння ядерних геномів:

Культурні рослини, як правило, мають значно більші геноми, ніж модельний об'єкт; малий геном арабідопсису робить його зручним: розібратися в меншій «ємності» простіше, а потім результати переносять на складніші геноми.

Приклад родини Пасльонових — розмір геному зростає в ряду картопля (2n = 48, ~0,8 Гб) → томат (~0,9 Гб) → баклажан (менше хромосом, але більше ДНК) → петунія (2n = 14, але великий геном) → тютюн (~4,5 Гб) → червоний перець (найбільший серед «природних» геномів родини). Тобто кількість хромосом і розмір геному не корелюють прямо.

Міжвидова гібридизація з подальшою поліплоїдизацією стрибкоподібно збільшує геном; далі в еволюції непотрібні послідовності поступово втрачаються, і геном стабілізується на новому рівні (числа хромосом і кількості ДНК). Багато культурних рослин у природі не трапляються саме тому, що вони — гібриди.

Задокументовані приклади:

• Тютюн курильний (Nicotiana tabacum) — алотетраплоїд, що об'єднує геноми N. sylvestris і N. tomentosiformis (по 24 хромосоми від кожного), звідси великий геном.
• Слива домашня — за поширеною гіпотезою походить від схрещування терну й аличі; має вдвічі більше хромосом, ніж батьківські види. Схрещування терну й аличі відтворено експериментально: отримано аналог домашньої сливи (з проблемами фертильності, але частину фертильних зразків вдалося відібрати).
• Суниця ананасна (садова «полуниця», Fragaria × ananassa) — історія, що відбулася «на очах людини»: до Франції з Чилі довезли лише жіночі рослини F. chiloensis; найкращий урожай вони давали поряд із F. virginiana; з насіння таких гібридів селекціонери отримали садову суницю. На початку XX ст. її схрестили з мускусною суницею (F. moschata) — виник гібрид «земклуніка» (прямостоячі квітконоси, більше вусів, менша кислотність, сильніший аромат, щільніші плоди).
• Пшениці — найскладніша історія:
  • вихідна — дика однозернянка (Triticum boeoticum, геном A), Мала Азія, Греція, порушені місця;
  • спонтанна гібридизація на полях давньої людини з бур'янами роду Aegilops (циліндричні колоски) дала форми з вищою врожайністю й крупнішим зерном;
  • T. urartu (Aᵘ) × Ae. speltoides (B/G) → тверді (тетраплоїдні) пшениці (AABB);
  • тетраплоїд × Ae. tauschii (Ae. squarrosa, «розчепірений», геном D) → м'яка пшениця (гексаплоїд AABBDD), утричі більше хромосом, ніж у вихідної диплоїдної пшениці;
  • наслідок: багато генів представлені трьома гомеологічними копіями, не всі з них працюють; гібрид має гетерозисну силу, більшу врожайність і фізіологічну пластичність, але вивчати такі об'єкти складно.
• Грицики (Capsella bursa-pastoris) — приклад серед дикорослих: у Середземномор'ї відбулася гібридизація між C. grandiflora (Греція, Албанія) і C. rubella (Центральна Європа). Алополіплоїд із подвоєним набором хромосом від двох видів має вищу насіннєву продуктивність і пластичність і став космополітним бур'яном.
• Банани — вихідні види Musa acuminata (тропіки) та M. balbisiana утворювали насіння (плоди поїдали тварини й поширювали насіння). Гібридні культивари різного походження; закріплювали ознаку безнасінності. Найпоширеніший сорт Кавендиш — триплоїд, насіння не утворює і розмножується вегетативно.
• Лілійник рудий (Hemerocallis fulva) — триплоїд, що виник у Китаї від схрещування диплоїдних і тетраплоїдних форм; караванними шляхами потрапив до Візантії й Середземномор'я. Щонайменше ~2000 років не утворює насіння, але широко поширився вегетативно (люди викидають надлишки з ділянок — виникають здичавілі зарості).

Терміни: автополіплоїдія (подвоєння власного геному), алополіплоїдія (об'єднання геномів різних видів), гомеологічні гени, гетерозис.

Задокументовані «алополіплоїдні» історії: два види → гібрид → подвоєння хромосом → новий вид

Склад геному. Значну частку (іноді понад половину) займають ретроелементи / ретротранспозони — саме вони найбільше відповідають за мінливість розмірів геному навіть у близьких видів.

Принцип «copy–paste». Активна копія транскрибується → з РНК-копії зворотна транскриптаза синтезує ДНК → двоколанцюгова ДНК-копія вбудовується в нове місце. Тому за наявності активних копій елементи самі себе розмножують.

«Егоїстична ДНК». Ретроелементи не дають рослині селективної переваги й не беруть участі в регуляції — «живуть для себе» і засмічують геном. Геном з ними бореться (видаляє непотрібні послідовності, «замовчує» їх), а вони знову розмножуються.

Будова й білок. Зазвичай одна рамка зчитування кодує поліпротеїн із кількома доменами:

• протеаза — розрізає поліпротеїн на функціональні білки;
• зворотна транскриптаза — синтез ДНК на матриці РНК;
• РНКаза H — видаляє РНК із гібрида РНК/ДНК;
• інтеграза (ендонуклеазна активність) — робить розріз і вбудовує нову копію.

Життєвий цикл: транскрипція активної копії → зворотна транскрипція → видалення РНК і добудова другого ланцюга ДНК → розріз у новому місці й вставка.

Класифікація.

• Елементи обрамлені повторами, які зберігають цілісність інформації.
• LTR-ретротранспозони (з довгими кінцевими прямими повторами, long terminal repeats): довжина LTR — від ~76 bp до ~5 kb, довжина елементів — до ~24 kb. За положенням гена інтегрази поділяються на:
  • Ty3/Gypsy (уперше описані в дріжджів, потім у дрозофіли): PR – RT – RNase H – INT;
  • Ty1/Copia: PR – INT – RT – RNase H. Нагадують ретровіруси, але не мають білка капсиду — не пакуються й не переходять між рослинами; живуть у межах клітини.
• Не-LTR ретроелементи: LINE (long interspersed nuclear elements, до ~7 kb, автономні — кодують власні білки) і SINE (short interspersed nuclear elements, неавтономні — використовують ферменти LINE).

Під час зворотної транскрипції накопичуються помилки, тому активних копій мало, а більшість геному засмічено неактивними копіями, які вже не кодують повноцінного білка.

Приклад петунії. Ретротранспозони займають до ~40 % геному, ~4,5 тис. копій. FISH-зонди до Gypsy-подібних елементів фарбують практично всі хромосоми, з концентрацією в центромерних ділянках. Число копій варіює навіть між сортами та особинами, тому розмір геному завжди наближений.

Ендогенні параретровіруси петунії. Окрім ретроелементів, геном гібридної петунії містить вбудовані копії вірусів родини Caulimoviridae (як вірус мозаїки цвітної капусти, CaMV) — вірус просвітлення жилок петунії (PVCV). Порівняно з ретроелементами вони мають додаткові білки:

• білок руху (movement protein) — взаємодіє з системою міжклітинного транспорту (плазмодесмами);
• білок оболонки (coat protein) — утворення капсиду. Інтегровані копії локалізуються переважно в перицентромерних ділянках (FISH), тоді як, наприклад, гени 5S рРНК — у строго визначених ділянках (на хромосомі 2).

Історія «завірусованості». Дикі види (напр., Petunia parodii) PVCV не містять. У XIX ст. петунію розмножували як теплолюбний багаторічник живцями — так у геномі накопичилися віруси: ~50 ділянок із вірусними послідовностями, з них лише ~4 повноцінні копії (у менш культивованих — 1). Петунія також «нахапалася» фрагментів вірусів з інших рослин (CaMV, віруси рису, банана, троянди, винограду) — ймовірно, через брудний інструмент під час живцювання; повних копій цих вірусів немає.

Сайленсинг. Щоб жити на вірусному фоні, рослина використовує сайленсинг («замовчування») надто активних послідовностей. Ефективність сайленсингу знижується з віком:

• 1-й міс. культивування — низький рівень вірусної РНК;
• 2-й міс. — ×2; 3-й — ×17; 4-й — ~×100 000. Сорти петунії із «зірчастим» забарвленням: білі смуги — результат сайленсингу гена халконсинтази (CHS). У молодих рослин смуги чіткі; у старих сайленсинг слабшає, квітки стають суцільно малиновими, а одночасно проявляються симптоми вірусної інфекції (світлі жилки, деформовані листки та пелюстки).

Стрес активує віруси. Експеримент: регулярне обрізання рослин (для компактного габітусу) через 3 міс. призвело до симптомів у ~30 % рослин; без пошкоджень, на доброму агрофоні — лише у 2–3 %. Посуха, перегрів, механічні пошкодження активують ендогенні віруси.

Принцип «cut–paste». Нерепліктивні транспозони вирізаються зі старого місця й переносяться в нове. Їх відносно небагато, але їхня активність впливає на безліч ознак залежно від того, в яке генне оточення вони потрапили.

Відкриття Барбари Мак-Клінток (1940-ві; публікації 1946–1950). Цитогенетик, вивчаючи строкате забарвлення зернівок кукурудзи, помітила хромосому, яка постійно ламається в тому самому місці. Локус назвала Ds (Dissociation, дисоціатор). Дисоціатор працює лише на фоні іншого локусу — Ac (Activator, активатор).

• У відламаному плечі хромосоми є алель червоного забарвлення; у гетерозиготи (друга хромосома несе рецесивний алель) втрата плеча дає білі сектори → строкатість.
• Без Ac зернівки забарвлені рівномірно.
• Наукова спільнота довго не вірила (геном вважали стабільним), доки подібні елементи не знайшли в інших організмів і не охарактеризували молекулярно. Нобелівська премія — 1983 р. Мак-Клінток очолювала Генетичне товариство Америки, стала «живою легендою», на її честь випущено поштові марки.

Будова системи Ac/Ds.

• Ac (~4,6 kb) обрамлений короткими кінцевими інвертованими повторами (TIR, ~11 bp), які утворюють петлю. Усередині — ген транспозази (~3,5 kb).
• Транспозаза впізнає TIR, вирізає елемент (з 1–2 додатковими нуклеотидами) і вбудовує його в нове місце, часто в межах тієї ж хромосоми.
• Ds — широкий клас дефектних елементів: зіпсована транспозаза або взагалі лише TIR. Переміщуються тільки за наявності транспозази від Ac.
• TIR гомологічні межам інтронів, тож вставка в ген може «вирізатися» під час сплайсингу.
• У геномі кукурудзи — 2–4 активні Ac (у деяких ліній — жодного) і до ~50 Ds різної будови.

Фенотипові наслідки залежно від місця вставки:

Крім того, Ds може спричиняти розриви та втрату фрагментів хромосом (втрата алелів, як у класичному досліді).

«Транспозонний фенотип». Строкаті плями, малюнок яких не повторюється від квітки до квітки (стохастичність). Розмір плями залежить від моменту «стрибка»: рано в розвитку — великий сектор, пізно — точки й штрихи.

• Tam — транспозони левиного зіва (Antirrhinum majus);
• Tmg — транспозони нічної красуні (Mirabilis jalapa): незалежна активність двох транспозонів у генах антоціанів і жовтих пігментів дає комбіновані рожеві й жовті сектори;
• приклади: строката насіннєва шкірка квасолі, білі плями в листі настурції, червоні — в колеуса, жовті штрихи на червоній троянді. Троянда: транспозон, імовірно, в екзоні гена червоного забарвлення — вихід руйнує ген, тому червоний фон «розсипається» на жовті/білі плями; суцільно біла троянда вже стабільна. Колеус: вихід відновлює функцію → червоні плями; суцільно червоний колеус — транспозон пішов.

Регуляція активності. Транспозон активується разом з геном, у якому сидить. Стани: неактивний (метилювання, модифікації хроматину) → криптичний (у гетерохроматині, рідко використовувана ділянка) → активний (коли ділянка «розплітається» і транскрибується). Тому найбільш мутабельні саме активно працюючі ділянки геному.

Транспозони як інструмент генетики.

• Термочутливі алелі: транспозаза активна при ~16 °C і неактивна при ~28 °C. Підвищення температури «заморожує» алель: якщо смугастість зникає й нові квітки однотонні — транспозон точно сидить у гені забарвлення.
• Транспозони програмують і долю органів: ген DEFICIENS левиного зіва — в одній квітці сектори з нормальними й недорозвиненими пелюстками; FLORICAULA (контроль квітки й суцвіття) теж уперше виявлено завдяки транспозону.
• До винайдення ПЛР (поч. 1990-х) транспозонне мічення (transposon tagging) було головним способом клонування генів; тому левиний зів (багато активних транспозонів) був зручним об'єктом.
• В арабідопсису власні ДНК-транспозони слабоактивні; можна пересаджувати чужі системи (напр., Ac/Ds), і вони працюватимуть. Перевага арабідопсису — низька копійність повторів у геномі.

• ДНК низької складності, сателітні послідовності — частково не досліджені, займають різну частку геному.
• Без повторів жити неможливо:
  • теломери — кінцеві повтори; при реплікації хромосома недочитується й вкорочується; спеціальні ферменти (теломераза) добудовують кінці, а відсутність кодувальних послідовностей у теломерах захищає важливі гени від втрати;
  • центромерні/кінетохорні повтори — до кінетохора прикріплюється багато мікротрубочок, для організації такої ділянки потрібна однорідна повторювана ДНК.

Частка геному. У Пасльонових — від чверті до третини. Найбільш досліджувана й найцінніша частина.

Мультигенні родини. Гени об'єднуються в родини за функцією та структурою; великі родини поділяють на класи. Причини множинності:

• потреба в масовому продукті (напр., тандемні повтори генів рРНК для рибосом);
• спеціалізація близьких продуктів у різних клітинах і процесах — основа для морфологічних, анатомічних і біохімічних інновацій. Недостатньо складний геном має обмежені можливості.

Будова білок-кодуючого гена еукаріотів: промотор → кодувальна частина (екзони/інтрони) → термінатор. Транскрипція від 5′-кінця; пре-мРНК → сплайсинг → зріла мРНК з 5′-кепом і 3′-полі(А)-хвостом (не записаний у ДНК, додається за сигналом термінації; дає стабільність). Прокаріотичні РНК мають на 3′-кінці шпильку; у цитоплазмі еукаріотів такі РНК сприймаються як чужорідні й швидко деградують. Трансляція — від ініціюючого кодону (з контекстом) до стоп-кодону.

Посттрансляційні етапи: N-кінцеві сигнальні/транзитні послідовності спрямовують білок у ЕПР, вакуолю, мітохондрії, хлоропласти (для цитозолю лідер відсутній); пре-білок процесується (відщеплення частин), глікозилюється, модифікується → зрілий білок.

Номенклатура генів і мутантів (ядерні гени)

Існує міжнародна номенклатурна комісія з еукаріотів:

• Ген позначають скороченням з 1–3 літер, часто за назвою мутанта або ферменту: AG (AGAMOUS), VDE (віолаксантин-де-епоксидаза). Дослідники прагнуть запам'ятовуваних назв: UFO = UNUSUAL FLORAL ORGANS. Паралельні назви в різних лабораторіях згодом зводять за пріоритетом; зайняту назву змінюють.
• Цифра одразу після літер, без дефісу: SOC1, CLV1, CLV3, AP1, AP2. Часто (але не завжди!) це члени однієї родини: CLV1 (рецепторна кіназа) і CLV3 (пептид) — різні родини; AP1 (MADS) і AP2 (AP2/ERF) — теж.
• Дикий алель — ВЕЛИКИМИ літерами курсивом: AGAMOUS, AG.
• Мутантний алель — малими літерами курсивом, номер алеля через дефіс: ag-1, ap2-5, ap2-7 (нумерує лабораторія, що отримала мутацію).
• Спрямовані амінокислотні заміни: CLV1(R204F) — аргінін у позиції 204 замінено на фенілаланін (однолітерні коди амінокислот).
• Ортологи з інших видів: префікс із роду й виду — ZmAG (кукурудза Zea mays), NtAP2 (Nicotiana tabacum), Os… (рис Oryza sativa). Увага: Ps може означати і горох (Pisum sativum), і сосну (Pinus sylvestris) — завжди читайте, які об'єкти досліджували.
• Білок — прямим шрифтом: AG, AP2 (у ядерних — зазвичай великими літерами).
• Гени часто названо за мутантним фенотипом, тож функція протилежна назві:
  • PIN-FORMED (PIN1) — мутант має голий «шпилькоподібний» стебло без квіток; функція гена — забезпечувати утворення органів (транспорт ауксину);
  • CAULIFLOWER — у мутанта суцвіття з недорозвинених квіток (як цвітна капуста); ген забезпечує нормальний розвиток квіток;
  • SEPALLATA — у мутанта всі органи квітки перетворюються на чашолистки (sepals); ген потрібен для розвитку пелюсток, тичинок і плодолистків.

Бокси та домени.

• Бокс — консервативна послідовність ДНК (у промоторі чи кодувальній частині), що вказує на спорідненість або функцію:
  • TATA-бокс — ~30 нт до старту транскрипції, маркер промотора;
  • G-бокс — промоторний мотив, який зв'язують PIF (phytochrome-interacting factors); гени з G-боксом відповідають на фітохромні сигнали;
  • F-бокс — ділянка ~50 амінокислот в убіквітин-лігазах, забезпечує білок-білкові взаємодії при убіквітинуванні;
  • MADS-бокс — кодує MADS-домен (~56–58 а. к.) факторів транскрипції, що зв'язує ДНК.
• Домен — консервативний фрагмент білка (α-спіралі, β-структури, мотиви), що визначає його функцію/взаємодії:
  • гомеодомен — ~60 а. к., зв'язує ДНК (на рівні ДНК відповідна ділянка — гомеобокс);
  • CHASE-домен — ~200–230 а. к., у рецепторних кіназах (рецептори цитокінінів);
  • ABA-зв'язувальний домен — у рецепторах абсцизової кислоти.
• РНК-продукт позначають так само, як ген (зрозуміло з контексту).

Пластидні й мітохондріальні гени — за правилами номенклатури прокаріотів (історично дві комісії не домовилися про єдину систему). Спільне: гени — курсивом, білки — прямим шрифтом. Три малі літери + за потреби велика: psaA, atpB, rbcL; білки з великої літери; для численних родин — номер: rps12 (рибосомний білок малої субодиниці 12). Окремого позначення для мутантних алелів немає — тож слід пам'ятати, про який геном ідеться.

На рівень експресії конкретного гена впливають три групи чинників:

1. Цис-фактори — послідовності ДНК, що оточують ген або входять до його складу. Багато їх зосереджено в промоторах: це регуляторні бокси, з якими зв'язуються фактори транскрипції.
2. Транс-фактори — фактори транскрипції (ФТ): активатори та репресори (останні, входячи до транскрипційних комплексів, пригнічують активність).
3. Стан хроматину — разом із ФТ до комплексу часто залучаються фактори ремоделювання хроматину: ділянка або розпушується (ген і його оточення активуються), або конденсується (ген «виводиться з обігу»).

Для арабідопсису побудовано «карту» родин ФТ: кожне коло — родина, площа кола пропорційна кількості генів (від величезних родин до таких, що містять 1–2 гени). ФТ мають домени: одні забезпечують специфічне впізнавання регуляторних послідовностей ДНК, інші — білок-білкові взаємодії; часто в одному білку кілька доменів.

Огляд основних родин:

Гормонзалежні ФТ.

• Мутант кукурудзи vp1 (viviparous1): зернівка проростає просто в качані — у зародка немає спокою, не накопичуються запасні речовини, відсутнє антоціанове забарвлення алейрону — синдром порушеної відповіді на АБК. Отже, той самий тип домену (B3) використовується для відповіді на різні гормони.

Гомеодомен.

• Назва — від гомеозисних змін у тварин: у дрозофіли мутації комплексу Bithorax дають «дві груди» (замість жужжальців розвивається ще одна пара крил).
• У рослин гомеодомен довго не знаходили, хоча гомеозисні мутації рослин були відомі. Гомологія з тваринами стосується лише самого гомеобоксу/гомеодомену; решта білків дуже відмінна.
• Першими знайшли KNOX-гени (від KNOTTED1 кукурудзи — «вузлик»: при порушенні меристематична активність з'являється в листках, утворюючи нарости). KNOX контролюють меристематичну активність пагона.
• HD-ZIP (гомеодомен + лейцинова блискавка) — програма розвитку листка, визначення верхньої/нижньої поверхні.
• WOX — розмір меристем кореня й пагона, проліферація і диференціація.
• Є родини, що поєднують гомеодомен і цинкові пальці.

AP2/ERF — родина, уперше відкрита в рослин. APETALA2 («безпелюстковий») контролює розвиток органів квітки: у мутанта ap2 зникають пелюстки (та змінюється ідентичність інших органів).

MADS-бокс.

• Історія: у арабідопсису (мутант agamous) і левиного зіва (мутант deficiens) знайшли гени з доменом, спільним лише для двох відомих на той час білків: MCM1 дріжджів (підтримання мініхромосом) і SRF людини (фактор відповіді на сироватку). Акронім MADS = MCM1 + AG + DEF + SRF.
• Функціонують як тетрамери різних MADS-білків, що зв'язуються з ДНК.
• Контролюють ідентичність органів квітки: мутант agamous — махровість: тичинки й маточка не розвиваються, у центрі квітки утворюються нові пелюстки й чашолистки.
• Велика родина, яку рослини використовують для регуляції багатьох процесів.

MYB.

• Назва — від вірусу мієлобластозу птахів (avian myeloblastosis virus), онкоген якого (v-myb) спричиняє лейкоз у птахів (неконтрольований поділ лімфоїдних клітин, загибель птаха).
• Будова: до трьох тандемних повторів (R1, R2, R3) по ~50 а. к., кожен із трьох α-спіралей. Не всі члени мають повну структуру: є R2R3-, R1-тип тощо; до повторів приєднані різні регуляторні частини, тож функції різняться.
• У хребетних лише 3 гени з повними R1R2R3 (контроль проліферації і диференціації).
• У арабідопсису — ~200 генів (198) із MYB-повторами, а з м'якшим критерієм гомології — понад 300. Повних R1R2R3 — лише ~5, більшість — R2R3-тип, решта — атипові.

bHLH. Основний (лужний, позитивно заряджений) домен електростатично взаємодіє з ДНК (кислотою); далі спіраль–петля–спіраль. Працюють як димери, які обхоплюють ДНК, «наче щипці». Можуть поєднуватися з лейциновою блискавкою (bZIP): гідрофобні лейцини двох α-спіралей взаємодіють, забезпечуючи димеризацію.

WD40-білки самі з ДНК не зв'язуються (у вузькому сенсі не є ФТ), але слугують каркасом (платформою) для збирання транскрипційних комплексів.

• Спорідненість довели не одразу: послідовності дуже різні; єдиний регулярний мотив — триптофан (W) і аспарагінова кислота (D) приблизно через кожні 40 а. к. → WD40.
• Просторова структура — β-пропелер із різною кількістю «лопатей» (що ускладнює аналіз); можуть мати додаткові домени.
• Функції: збирання транскрипційних комплексів; мембранні сигнальні комплекси; убіквітинування білків-мішеней; формування клітинної стінки тощо.

MBW-комплекс (MYB–bHLH–WD40). На WD40-білок «нанизується» bHLH-фактор, до нього приєднується MYB-фактор → транскрипційний комплекс, що регулює дуже багато процесів. Центральний WD40-білок арабідопсису — TTG1 (TRANSPARENT TESTA GLABRA1). Залежно від bHLH- і MYB-партнерів комплекс контролює:

• розвиток трихом на листках (GLABRA: GL1 — MYB, GL3/EGL3 — bHLH);
• розвиток кореневих волосків (тут подібний комплекс діє як репресор);
• пігментацію насіннєвої шкірки (TRANSPARENT TESTA: TT2 — MYB, TT8 — bHLH);
• синтез антоціанів, слизу насіннєвої шкірки, накопичення жирів і запасних білків, час цвітіння, відповіді на біотичні й абіотичні стреси.

Структурно подібні MYB можуть бути як активаторами, так і репресорами («дзеркальна» функція).

Принцип специфічності (ієрархія):

Кукурудза: локус B (Booster, bHLH). Різні алелі визначають місце синтезу антоціанів:

• алель типу B-I — забарвлення лише вегетативних органів: проросток інтенсивно забарвлений, під час достигання — обгортки качана (зелені листкові тканини), але не зернівки → контраст між жовтими зернівками й темними обгортками;
• алель B-Peru — забарвлює й листки, і зернівки (майже чорні). Такий контроль через bHLH рідкісний; частіше специфіку задають MYB.

Петунія: чотири MYB-активатори антоціанів (назви історичні):

• AN2 (ANTHOCYANIN2) — працює в відгині (лімбі) зрослопелюсткового віночка: забарвлений відгин і біла неснарбована пляма в зіві;
• AN4 — працює в трубці віночка: якщо діє лише він — чітка кругла пляма в центрі;
• DPL (DEEP PURPLE) — прив'язаний до жилок: глибоке малинове жилкування;
• PHZ (PURPLE HAZE) — «пурпуровий серпанок» на зворотному боці пелюсток і в чашолистках, у бутонах; індукується світлом, захист від УФ (білі квітки можуть мати забарвлені бутони).

Крім активаторів є MYB-репресори (напр., MYB27, MYBx), що конкурують за місце в комплексі.

Залежність від світла: на яскравому сонці/УФ рослини «засмагають» (бронзове, червонувате забарвлення) — різко зростає експресія MYB-активаторів (переважно PHZ, трохи DPL), тоді як рівень WD40 і bHLH майже незмінний. У темряві/тіні зростає експресія репресора MYB27 → антоціанів менше.

Масштаб регуляції: надекспресія MYB-активаторів (PHZ, DPL) посилює експресію практично всіх генів біосинтезу антоціанів — від фенілаланін-аміак-ліази (PAL) до антоціанідинсинтази, глікозилтрансфераз і генів транспорту у вакуолю. Один комплекс запускає цілий фізіологічний процес.

Вакуоля та pH. Накопичення антоціанів неможливе без підкислення вакуолі протонними АТФазами тонопласта; заряд мембрани забезпечує транспорт антоціанів; кінцевий pH вакуолярного соку визначає відтінок кольору. Відповідні гени петунії названо PH (від pH):

• PH1, PH5 — протонні помпи (P-АТФази) тонопласта;
• PH4 — MYB-фактор, що в складі MBW-комплексу регулює вакуолярні процеси й вмикає гени вторинної відповіді — WRKY-фактор (PH3), а той — ефекторні гени підкислення. Тобто «оркестрований» розв'язок задачі забарвлення: ферменти фенольно-флавоноїдного шляху + транспорт у вакуолю + підкислення (кількість і відтінок пігменту) + стабільність до вицвітання — для залучення запилювачів.

Аромат. MYB-фактор петунії ODORANT1 (ODO1) перемикає фенольний метаболізм з антоціанів на летючі бензеноїди/фенілпропаноїди (ванілін, бензилбензоат, метилбензоат, евгенол, ізоевгенол). У видів, що запилюються нічними комахами, MYB-фактори також активують ABC-транспортер плазмалеми, що виводить летючі речовини й посилює запах. Ті самі комплекси, але з іншими MYB-компонентами.

WRKY — вторинні ФТ, що зазвичай вмикаються після MBW-комплексу (можливо, іноді входять до більших комплексів чи мають власні мішені). Назва — від тандему W-R-K-Y (триптофан–аргінін–лізин–тирозин); мотив зв'язує Zn, β-складки взаємодіють з ДНК.

Не всі ФТ зв'язуються з ДНК: до справжніх ФТ (напр., MADS) приєднуються транскрипційні кофактори, які рекрутують комплекси модифікації та ремоделювання хроматину. Великий транскрипційний комплекс: один білок впізнає промотор, решта — модифікують хроматин.

Механізми:

• Метилювання ДНК — мітка зниження активності: метильовані гени менш активні;
• Модифікації гістонів, зокрема ацетилювання (гістонацетилтрансферази / деацетилази) — впливають на ступінь збирання нуклеосом;
• РНК-спрямоване ущільнення: за гомологією з некодуючою РНК ділянка ДНК, визнана «шкідливою» (напр., транспозон), ущільнюється й вимикається;
• АТФ-залежні комплекси ремоделювання:
  • assembly — збирання нових нуклеосом на вільній ДНК;
  • sliding — ковзання нуклеосоми вздовж ДНК без втрати зв'язку;
  • eviction — «виселення» нуклеосом (розбирання, ДНК розплітається й активується);
  • unwrapping — послаблення зв'язку ДНК з гістонами;
  • заміна гістонів варіантами (зміна складу октамеру), що змінює конформацію ДНК.

Інсулятори. Розплітається не вся ДНК одразу, а ділянки, обмежені інсуляторами, що поділяють геном на функціональні домени (петлі). Між двома інсуляторами — кілька генів подібної функції; щоб їх активувати, петлю треба розпушити, а щоб вимкнути — компактизувати. У основі петель — комплекси ремоделювання. Отже, важливе генне оточення й розташування інсуляторів. У рослин інсулятори передбачаються, але молекулярні механізми їх впізнавання ще не досліджено.

Polycomb — перемикання програм розвитку. Гени групи Polycomb (уперше знайдені в дрозофіли) у рослин критичні для зміни фаз розвитку:

• пригнічення всієї системи → сильно спотворені рослини з порушеною диференціацією («мішанина» тканин), часто летальні;
• окремі компоненти (комплекс PRC2):
  • гени FIS (FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED: MEDEA, FIS2, FIE) — синхронізація розвитку зародка й ендосперму; при мутаціях ендосперм (чи навіть зародок у fie) розвивається без запліднення;
  • EMF (EMBRYONIC FLOWER) — перехід до вегетативного розвитку; у мутанта одразу після сім'ядоль утворюється квітка (без вегетативної фази);
  • яровизація (вернализація) і стратифікація насіння — тривале охолодження переводить рослину із «зимового» стану до цвітіння чи проростання; також регулюється через пакування хроматину (епігенетичне вимкнення FLC).

Підсумок: експресія гена визначається (1) цис-елементами в промоторах, (2) транс-факторами (ФТ та інші компоненти транскрипційних комплексів) і (3) факторами ремоделювання хроматину, що здійснюють глобальну регуляцію активності геному.

Корончасті гали. 1907 р. із корончастого гала виділено Agrobacterium tumefaciens. Пухлини злоякісні: навіть після знищення бактерій антибіотиком ріст триває. Хвороба зазвичай починається біля кореневої шийки, далі бактерії можуть поширюватися вгору; у тяжких випадках гал «стягує» всі поживні речовини, рослина дає лише слабкі пагони.

Споріднені види та їхні хвороби:

Агробактерії генетично близькі до ризобій (родина Rhizobiaceae).

Пошук господаря (хемотаксис). Пошкодження коренів дводольних виділяє фенольну сполуку ацетосирингон; руйнування клітинної стінки звільняє глюкуронову/галактуронову кислоту, арабінозу, глюкозу — ще один сигнал. Бактерії спрямовуються до поранення.

Опіни — нові речовини в пухлині, продукти конденсації двох молекул (амінокислота + кетокислота, цукри тощо) з частковим відновленням:

• нопалін = аргінін + α-кетоглутарат;
• октопін = аргінін + піруват (уперше виділений 1927 р. з м'язів восьминога Octopus; у молюсків утворюється при гіпоксії — відновлювальні еквіваленти NADH «скидаються» на багаті азотом сполуки, а не на піруват→лактат, як у людини);
• агроцинопіни A/B — фосфодиефіри цукрів; манопін — маноза + глутамін(ат); кукумопін — похідне гістидину; агропін (у Ri-плазмід).

Класифікація штамів за опіном: нопалінові, октопінові тощо. Різні опіни в одній пухлині зазвичай не трапляються; між штамами є конкуренція.

Біологічний сенс опінів («генетична колонізація»): рослина не здатна їх катаболізувати → продукти фотосинтезу та елементи живлення (N, P) вилучаються з її метаболізму; рослина у відповідь шле в пухлину нові порції N, P, асимілятів, а пухлина знову робить із них опіни — так «стягує» ресурси з усієї рослини. Опіни катаболізує лише агробактерія відповідного типу (гени катаболізму — на тій самій плазміді).

Для поділу клітин потрібні ауксини й цитокініни. Тканину пухлини, звільнену від бактерій, вирощують in vitro без додавання гормонів — вона синтезує їх сама. Пухлина пронизана ксилемою і флоемою. Видимий гал з'являється приблизно за місяць.

Ti-плазміда визначає вірулентність і коло господарів:

• vir-ділянка (оперони virA–G): мутації різко знижують вірулентність;
• Т-ділянка (T-DNA) під дією продуктів vir копіюється, переноситься в клітину господаря й інтегрується в геном.

Особливості: великий розмір (~200 kb, важко маніпулювати напряму); низька копійність (власний ori); легко втрачається (у ґрунті лише ~5 % клітин вірулентні); здатна до кон'югативного переносу пілею (активується пораненим господарем/опінами); дає селективну перевагу в пухлинах. У природі вражає переважно дводольні, але є протоколи й для однодольних та голонасінних.

• Усі види, включно з непатогенним A. radiobacter, конкурують за корені: корінь, колонізований A. radiobacter, гірше заражається патогенами.
• Ризобії специфічно взаємодіють з господарем завдяки великій симбіотичній плазміді (pSym): R. leguminosarum — горох; R. phaseoli — квасоля; Sinorhizobium meliloti — люцерна/буркун; Bradyrhizobium japonicum — соя. Без pSym бульбочки не утворюються — пряма паралель з Ti-плазмідою.

Усунення агробактерій. У лабораторії — цефалоспорини (цефотаксим/клафоран) у високій дозі (у рослин немає мішені, тож концентрацію можна підняти, потім знижувати). У полі — агротехніка (зволоження, кількарічні однодольні), біоконтроль непатогенним A. radiobacter K84 (нестабільний) та бактеріофаги (1975 р. — 4 помірні фаги; у полі знижують кількість галів на саджанцях ліщини).

Впізнавання пораненого господаря — система VirA/VirG.

• VirA — мембранний сенсор внутрішньої мембрани (гідрофобні α-спіралі, петля в періплазмі й петля в цитозолі); працює як димер, гістидинкіназа. Сайт зв'язування ацетосирингону — з внутрішнього (цитоплазматичного) боку.
• Малий білок ChvE зв'язує вільну галактуронову кислоту/моносахариди й підвищує спорідненість VirA до ацетосирингону.
• VirA автофосфорилюється по гістидину → переносить фосфат на аспартат VirG (фосфотрансмітер і фактор транскрипції) → VirG вмикає решту vir-генів. (Паралель: у рослин цитокініновий сигнал теж передається через рецепторні кінази His→Asp.)

Вирізання Т-ДНК. Межі (RB, LB) — консервативні 25 bp. Комплекс VirD2+VirD1 надрізає їх; VirD2 ковалентно приєднується до 5′-кінця одноланцюгової Т-ДНК (пілот-білок). Одноланцюгова Т-ДНК витісняється, а на місці добудовується новий ланцюг (реплікація за «котячим кільцем») — з однієї Ti-плазміди можна зробити багато копій Т-ДНК. Спроби скопіювати решту плазміди зазвичай невдалі (оцДНК швидко рветься).

Сім бар'єрів. Щоб потрапити з бактерії в ядро рослини, оцДНК долає 7 перешкод: внутрішня мембрана → періплазма → зовнішня мембрана → клітинна стінка → плазмалема → цитоплазма → ядерна оболонка.

Транспортний комплекс VirB (система секреції IV типу, T4SS). 11 білків оперону virB + VirD4:

• VirB4, VirB11, VirD4 — цитоплазматичні АТФази (гексамери): «ловлять» Т-ДНК і білки й змінюють їхню конформацію (розплітання + фолдинг, що потребує АТФ);
• VirB3/VirB6 — пора у внутрішній мембрані;
• VirB1 — гідроліз пептидоглікану (без цього збирання неможливе);
• VirB8/VirB10 — внутрішня частина пори; VirB7/VirB9 — проходження зовнішньої мембрани;
• VirB2 — білок пілі (спіральна укладка, порожниста всередині); VirB5 — «віночок» на верхівці, продірявлює мембрану господаря. Структурно й функціонально T4SS споріднена з кон'югативними системами плазмід (напр., RP4): той самий механізм переносу оцДНК з клітини в клітину був «злегка модифікований» для переносу в еукаріота. Тому агробактерія в експерименті може переносити Т-ДНК навіть клітинам тварин/людини — великої специфічності немає, пара «агробактерія–рослина» лише типова.

Адгезія. На поверхні агробактерії нерівномірно розташований уніполярний полісахарид (UPP), яким вона стає «сторч» у місці контакту; мутанти синтезу UPP прикріплюються боком. Міцний контакт потрібний для транспорту.

Імунна відповідь рослини. Рецептори плазмалеми впізнають консервативні бактеріальні молекули (PAMP): FLS2 — флагелін джгутиків; EFR — фактор елонгації EF-Tu. Кіназний каскад → ФТ (WRKY) → гени первинної імунної відповіді.

Як агробактерія уникає захисту. У клітину разом із Т-ДНК потрапляють білки, що маскують і спрямовують комплекс у ядро:

• VirD2 несе сигнал ядерної локалізації (NLS) → тягне приєднану Т-ДНК у ядро;
• VirE2 має три ролі: (1) щільно «одягає» оцДНК, захищаючи від нуклеаз (оцДНК у цитозолі — SOS-сигнал); (2) має власний NLS (резервний транспорт у ядро); (3) взаємодіє з активованим господарським білком VIP1, що також несе NLS, — комплекс додатково «вдягається» в хазяйський білок. Отже, комплекс тричі помічений сигналами (VirD2, VirE2, VIP1).
• VirF — компонент убіквітин-лігази (F-box), має спорідненість до VIP1 → після доставки в ядро VIP1 стає мішенню протеасоми й розбирається, не піднімаючи SOS-сигналу; VirD5 стабілізує VirF.

Інтеграція в геном. У ядрі VirD2 робить надрізи у випадкових місцях хроматину (неспецифічність важлива!). Репарація рослини йде переважно негомологічним з'єднанням кінців (NHEJ): розірвані кінці зшиваються з першим-ліпшим обривком → Т-ДНК вбудовується назавжди; одноланцюгова ділянка слугує матрицею для добудови.

Транзієнтна трансформація. Не всім копіям «щастить» інтегруватися: Т-ДНК може кілька днів «бовтатися» в ядрі, проявляючи генну активність, а потім втратитися під час поділу (тимчасова експресія). Тому частина клітин спершу виглядає трансформованою, але згодом втрачає ознаку.

Важливо: у Т-ділянці гени під еукаріотичними промоторами — всередині бактерії вони мовчать, працюють лише в рослині.

Мутанти патогенезу: tms (tumor morphology shoot, «коса шута») — пухлини з пагонами; tmr (tumor morphology root) — з коренями, пухлина більша. Функції:

• при пошкодженні біосинтезу ауксинів баланс зсувається до цитокінінів → пагони (отже, це гени синтезу ауксину);
• при пошкодженні синтезу цитокінінів — надлишок ауксинів → корені.

Синтез ауксину (ІОК) — два гени, два етапи:

• IaaM (tms1) — триптофанмонооксигеназа: триптофан → індол-3-ацетамід (одноетапне окисне декарбоксилювання);
• IaaH (tms2) — гідролаза: індол-3-ацетамід → індол-3-оцтова кислота (ІОК/ауксин). Індол-3-ацетаміду в рослинах зазвичай немає; синтез ІОК стає непідконтрольним рослині.

Звідки гени? У природі є бактерії, що модифікують ріст рослин через ауксин: Pseudomonas savastanoi (пухлини оливи), ендофіти P. syringae, Rhizobium тощо — доброякісні пухлини (після антибіотика ріст спиняється, бо немає гормон-незалежного росту). Ризобії теж несуть один із цих генів на pSym і «підганяють» господаря до утворення бульбочок.

Синтез цитокінінів — один ген:

• Ipt (tmr) — ізопентенілтрансфераза: переносить ізопентенільний залишок на аденінове ядро (у складі АМФ) → ізопентеніладенозин-монофосфат → далі (гідроксилювання, зняття фосфату/рибози) транс-зеатин. Один етап «оминає» кілька ферментів рослини → синтез цитокінінів теж непідконтрольний. Гомолог (tzs, транс-зеатинсинтаза) є поряд із vir-ділянкою — агробактерія сама виділяє трохи зеатину. Ген ipt є і в Xanthomonas oryzae (рис).

Локус tml (октопінові штами): синтез опіну + опінпермеаза (tml6a) для виведення опіну з клітини; tml6b — онкоген, здатний переміщуватися по рослині й викликати симптоми в нових місцях.

Ri-плазміда A. rhizogenes (агропіновий тип) має дві Т-ділянки — праву (TR) і ліву (TL):

• у TR — біосинтез ауксину й цитокініну та синтез опінів (подібно до нопалінової Т-ДНК);
• можна видалити майже всю TR, і патогенність зберігається за рахунок TL, де немає генів синтезу гормонів, але є гени rol (root loci: rolA, rolB, rolC, rolD) та відкриті рамки невідомої функції.
• Є природні кукумопінові/манопінові Ri-плазміди взагалі без правої ділянки й без генів синтезу гормонів.

Функції rol (вивчали надекспресією, переважно в тютюну й каланхое):

• rolA — зморщене листя, укорочене суцвіття;
• rolB — знижує апікальне домінування, дрібніші квітки, менше пилку; сильно підвищує чутливість до ауксину (гідрофобний; йому допомагає ORF13/ORF1); копія в TR;
• rolC — спершу думали, що це глікозидаза цитокінінів (підвищує рівень вільних цитокінінів); знижує чутливість до ауксину, зменшує розміри;
• rolD — імовірно, орнітинциклодеаміназа (синтез проліну з орнітину). Після перших публікацій досліджень мало — функції ще уточнюються.

• Культура «косматих коренів» — необмежено зростаючі корені без зовнішніх гормонів із власною біохімічною специфікою → наробка цінних вторинних метаболітів, які синтезуються саме в коренях.
• У стерильній культурі зручно вивчати взаємодію з мікоризними грибами (кусочок косматого кореня + спори мікоризи; на якій відстані проростають, якими стимулами) і нарощувати спори арбускулярних грибів для сільгосппрепаратів (у звичайній культурі ці гриби не ростуть).
• «Роззброєні» (disarmed) Ri-плазміди дають не такі косматі корені; придатні для об'єктів, що погано уражуються Ti-плазмідою. Китайські дослідники трансформують сою, лікарські дикороси, розробляють системи регенерації (м'якша система, що підштовхує до морфогенезу).

«Роззброєння» Ti-плазміди: з Т-ділянки видаляють онкогени (iaaM, iaaH, ipt) і вставляють гени інтересу + маркерні (відбір трансформантів) та репортерні (візуалізація) гени.

Піонери (1980-ті): Марк ван Монтегю (бельгієць) і Джефф Шелл у 1980-х висували ідеї: клонувати ген запасного білка бразильського горіха → перенести в сою; створити гербіцид-стійкі культури й продавати їх у парі з гербіцидом. У середині 1980-х це звучало як фантастика, але ~за 10 років опинилося на полях США. Згодом обидва працювали в лабораторіях Monsanto і створили ~80 % світових ГМ-рослин.

Методи роззброєння та векторні системи:

1. Гомологічна рекомбінація з коінтегративним вектором: онкогени заміщуються генами інтересу (ненадійно, історичне значення).
2. Бінарна система (сучасна): Ti-плазміду розділяють на (а) плазміду-хелпер із vir-ділянкою (маркується, напр., стійкістю до рифампіцину, тримається в агробактерії) і (б) малу бінарну плазміду з Т-ДНК, якою маніпулюють у E. coli. Vir-продукти in trans переносять Т-ДНК бінарної плазміди. Відбір за двома антибіотиками.
   • Порядок у Т-ДНК: ген інтересу — ближче до RB (добре захищений), селективний маркер — ближче до LB (часто ушкоджується): якщо LB-кінець «з'їдено», маркер пошкоджено й клітина відсіюється → гарантія інтеграції всієї конструкції.

Селективні гени: стійкість до хлорамфеніколу (старий); канаміцину (nptII, неоміцинфосфотрансфераза) — стандарт; гігроміцину (особливо рис); фосфінотрицин/гліфосат (гербіцидна стійкість). Сильні промотори: 35S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), промотор гена нопалінсинтази (nos) агробактерії; для однодольних — промотори убіквітину кукурудзи й актину рису (працюють краще). Репортерні гени: GUS (β-глюкуронідаза), GFP (зелений флуоресцентний білок) та інші.

Агробактерія вражає не всіх господарів, тому розроблено альтернативи.

Біобалістика (генна гармата). Мікрочастинки металу (напр., вольфраму, золота), вкриті ДНК, розганяють і «вистрілюють» у стерильну тканину; за інерцією частинки відриваються й проникають у клітини.

• Спершу використовували порох, але порохові гази (оксиди азоту) пригнічують ріст — перейшли на стиснений гелій/інертні гази із заслінкою.
• Недолік: частинки ушкоджують клітини (розрив вакуолі → загибель), тож обстріл має бути «м'яким».
• Переваги: трансформує не лише ядро, а й пластиди та мітохондрії (агробактерія для цього не годиться); у клітину потрапляє багато ДНК → можлива гомологічна рекомбінація при репарації. Є дорогі лабораторні установки (регулювання тиску, відстані, навіть керування польотом частинок електромагнітним полем) і дешеві портативні (для транзієнтної експресії).
• Транзієнтна експресія корисна там, де інтеграція не потрібна: напр., наробка білка, або запуск сайленсингу (anti-sense ДНК/РНК, РНК-інтерференція) для боротьби з вірусною інфекцією — обстріляний листок сам «вичищає» вірус.

Трансформація гострими наноматеріалами. Дуже тонкі й гострі об'єкти механічно надрізають ДНК/клітини:

• карбід кремнію (SiC) — тонкі гострі кристали: у розчин чужорідної ДНК додають суспензію SiC і клітини, різко збовтують → проколювання клітин і надрізи ДНК → з певною ймовірністю чужорідна ДНК вбудовується. Дешево й масово, хоча ефективність низька.
• вуглецеві нанотрубки — сучасна заміна SiC (подібний ефект проникнення й мікропошкоджень).
• (Пересторога: будь-який надріз ДНК — мутація; тому дуже тонкі волокна, як-от азбестовий пил, є потенційним мутагеном/канцерогеном — це треба враховувати, працюючи з ріжучими матеріалами.)

Підсумок: методи трансформації різноманітні, базуються переважно на агробактерії (найрозробленіше поле); у спеціальних випадках — біобалістика або трансформація нанотрубками/нанокристалами.

Будь-яка вставка ДНК у геном — це мутація. Навіть трансформація з самим лише селективним маркером дає вставку у випадкове місце; якщо вона потрапляє в ген чи промотор — виникає мутантний фенотип. Масова трансформація → багато інсерційних мутацій; далі доводять, що мутація пов'язана саме зі вставкою (ген «помічений» Т-ДНК → легко клонувати).

Транспозонний мутагенез. Транспозон вставляється / вирізається в межах однієї хромосоми. Конструкцію розбирають на дві частини:

• транспозаза під сильним промотором (на одній хромосомі) забезпечує стрибки;
• касета з селективним маркером (напр., стійкість до канаміцину), обрамлена TIR, перестрибує. Мутації виявляються зчепленими з маркером. Перевага: можна «прицільно» мутувати потрібну хромосому (куди вбудовано конструкцію).

Щоб маркер працював у всіх тканинах, його ставлять під конститутивні промотори (напр., промотор нопалін- або октопінсинтази агробактерії).

Вірусні сильні промотори:

• 35S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) — стандарт; від нього синтезується велика РНК (35S). У вірусу є РНК-стадія зі зворотною транскрипцією (помилки), тому використовують лише промотор, не весь вірус.
• щоб не провокувати сайленсинг при повторному використанні одного промотора для кількох генів, беруть промотори інших вірусів (напр., вірусу скручування листя томата та ін.).

Промотори генів «домашнього господарства» (для ширшого кола об'єктів, бо вірусні найкраще працюють у дводольних/пасльонових):

• актин (цитоскелет, потрібен у великій кількості) — напр. з арабідопсису або рису;
• убіквітин (кукурудзи) — для однодольних;
• для фотосинтезуючих тканин — мала субодиниця Rubisco (rbcS) та білок світлозбиральних комплексів (LHC/CAB); увага: вони мають добову динаміку (активні на світлі), на відміну від актину/убіквітину.
• для трансгенезу хлоропластів — промотор великої субодиниці Rubisco (rbcL) (закодована в пластому); Rubisco — найпоширеніший білок планети (до 40 % білка листка, до 60 % у водоростей).

Синтетичні промотори (біоінформатика):

• DR5 — ауксин-залежний: кілька тандемних копій ауксин-чутливих елементів (AuxRE) → спрацьовує навіть за низьких концентрацій ауксину; слугує «репортером розподілу ауксину»;
• мінімальні синтетичні промотори для сильної конститутивної експресії.

Метод аналізу промоторів (Нам-Хай Чуа, N.-H. Chua). До промотора малої субодиниці Rubisco приєднав ген стійкості (неоміцинфосфотрансфераза) і поступово вкорочував промотор у серії трансгенних ліній → знайшов, що ділянка ~–33 від TATA-боксу відповідає за світлову активацію (видалення → втрата відповіді на світло). Сучасні модифікації простіші, але принцип той самий: серія делецій промотора + репортер.

GUS (β-глюкуронідаза, uidA з E. coli). Розщеплює штучний субстрат X-Gluc → нерозчинна синя речовина (похідне індиго) там, де працював промотор. Приклади: PIN7 (транспорт ауксину — забарвлення стели й термінальної частини зародка); рецепторна кіназа, що вмикається за ~3 дні до цвітіння (забарвлення в приймочці). Недолік: об'єкт треба вбити (фіксація, просвітлення) → лише «моментальний знімок», динаміку в одного екземпляра не простежити. Приклад патерну під впливом: промотор PAL (фенілаланін-аміак-ліаза) гороху — відповідь на зараження фітофторою (стійка раса → реакція надчутливості, некроз, лігнінові бар'єри, конденсовані таніни, антоціани; сумісна раса проходить бар'єри).

GFP (зелений флуоресцентний білок, медуза Aequorea victoria). Світиться під синім світлом; не вбиваючи об'єкт. Хромофор дозріває зі зшивання трьох амінокислот (Tyr–?–Gly). Приклад: DR5::GFP показує динаміку ауксину в зародку (рівномірно на ранніх стадіях → кореневий полюс на стадії глобули → картина на стадії «торпедо»). Недолік: надто сильне/часте збудливе світло теж токсичне. Спектральні варіанти (інженерія GFP): BFP (синій, Tyr→His), CFP (ціановий, Tyr→Trp), YFP (жовтий, додаткова електронна густина) → спостереження за двома процесами; RFP/DsRed (корал Discosoma). FRET — передача енергії між близькими білками → виявлення взаємодії молекул. Інженери також оптимізують швидкість дозрівання (раніше зафіксувати ввімкнення) та швидку деградацію (швидко «гасне» після вимкнення).

Люциферази.

• Люцифераза світляка (субстрат люциферин) + просочування рослини люциферином → реєстрація світіння in vivo (напр., під LHC-промотором). Недолік: люциферин у високих концентраціях токсичний; успіх залежить від рівномірності просочення.
• Грибна люцифераза (напр., Neonothopanus/Omphalotus): працює від кофейної кислоти через ферменти (гіспідин-синтаза, гідроксилаза → 3-гідроксигіспідин = грибний люциферин). Треба перенести 3–4 грибні гени — і рослина світиться автономно, без субстрату ззовні. Світло в «зеленому провалі» хлорофілу (не поглинається). Дає змогу стежити за фенольним метаболізмом неінвазивно: механічне поранення → спалах за секунди; видно циркадні ритми.

Кольорові метаболіти як репортер — конструкція RUBY. Синтез бетанінів (буряково-червоні пігменти; буряк, кактуси, амарант, бугенвілія — замість антоціанів). RUBY = три злиті кодувальні ділянки ферментів синтезу бетаніну, розділені самовирізальними пептидами 2A, під 35S → червоне забарвлення без приладів і хімікатів; видно навіть трансгенні насінини в стручку. DR5::RUBY дає ті самі смуги вздовж жилок, що й GFP. Недолік: бетаніни накопичуються й не зникають → видно лише ввімкнення, не вимкнення. Застосування: томати, баклажани, картопля (стають стійкішими до грибних хвороб; бетаніни — антиоксиданти).

Пастки промоторів (promoter/enhancer trap). Безпромоторний GUS за транспозоном «ловить» промотори при перестрибуванні; приклад — промотор, активний у найповерхневішому шарі (протодерма/ATML1) → маркер поверхневих клітин.

Ектопічна експресія — активність гена не там, де належить. Класичний приклад — мутант Knotted1 (kn1) кукурудзи (вузлики на листку; перший знайдений у рослин гомеобокс-ген) — природна ектопічна експресія KNOX у листку. Сучасно: промотор одного гена + кодувальна частина іншого:

• STM (SHOOT MERISTEMLESS, KNOX) у примордії листка → збереження недиференційованого стану, тривала проліферація → лопатеві/зубчасті листки (замість гладкого краю в арабідопсису).

Система двох ліній (трансактивація, LhG4/Op або GAL4/UAS). Для слабких промоторів: лінія-драйвер (промотор гена 1 + химерний активатор на основі lac-репресора E. coli без репресорної функції) × таргетна лінія (кілька копій lac-оператора перед геном 2). Химерний білок зв'язує оператор і активує еукаріотичну експресію; оператора в геномі рослин немає → специфічність. Приклад: промотор APETALA3 керує AGAMOUS → втрата пелюсток і чашолистків, зупинка розвитку квітки.

Експресія вмикається за волею експериментатора.

Власні промотори рослин:

• білки теплового шоку (HSP, напр. HSP18.2) — індукція нагріванням до ~37–40 °C (HSP — шаперони фолдингу; активуються ФТ HSF зі структурою «спіраль-поворот-спіраль», що зв'язують HSE-елементи). Недолік — «підтікання» (leaky): за норми теж потрібно трохи HSP. Приклад: X-Gluc під HSP-промотором мовчить при 22 °C, після 30 хв нагрівання прошивається все; можна нагріти навіть окремі клітини лазером. Застосування: флориген (FT) під HSP-промотором в евкаліпта → кілька годин нагрівання → квітки за ~9 тижнів → прискорення селекції дерев.
• білки холодового стресу (COR) — індукція охолодженням до ~0–5 °C; ФТ типу AP2/EREBP (CBF/DREB); частково перекриваються з відповіддю на посуху; антифризні білки проти кристалів льоду.

Чужорідні (рослинам невластиві) індуковані системи — без «підтікання»:

• глюкокортикоїдна (GR) система (індуктор — дексаметазон): химерний білок lac-зв'язування + GR-домен + активатор (GAL4); без гормону зв'язаний з HSP90 у цитозолі й не йде в ядро; дексаметазон → звільнення → ядро → експресія. Приклад: подвійний мутант gl1 gl3 (голий лист) + pLGL3::GR-GL3: без дексаметазону — голу рослину; через 4 год після обробки — нові трихоми, через 7 днів — нові листки, суцільно вкриті волосками (обхід летальності ранньої надекспресії).
• естрогенна (людський ER) система (індуктор — естроген) — аналогічно; можна «намалювати» естрогеном літери й побачити локальну експресію. Недолік тваринних гормонів: повільна дифузія, бар'єри → реакція не охоплює всю рослину одночасно.
• етанол-індукована система (ФТ AlcR + промотор алкогольдегідрогенази alcA з Aspergillus): реагує на пари/полив спиртом; швидко поширюється по рослині (видно за люциферазою); лінійна відповідь у певному діапазоні.
• тетрациклінова система — активатор або репресор, злитий із tet-рецептором: з тетрацикліном ген вмикається або вимикається.

Антисенс-супресія (відкрита 1978 р.). Якщо в клітині одночасно є смислова мРНК і комплементарна антисенс-РНК — утворюється дволанцюгова РНК, яку клітина знищує → продукт не синтезується. У конструкції кодувальну частину гена пришивають до промотора (напр. 35S) у зворотній орієнтації. Достатньо навіть короткого фрагмента (~13–25 нт). Недолік: протяжні антисенс-ділянки вимикають і гомологічні гени родини — тому майже не використовуються.

Способи блокування на рівні РНК:

• антисенс-олігонуклеотиди блокують рух рибосоми; дволанцюгова ділянка — мішень для РНКази H;
• рибозими — штучна РНК з ділянкою гомології + рибозимною активністю розрізає цільову РНК;
• siRNA (мала інтерферуюча РНК) — короткий дволанцюговий фрагмент впізнається комплексом RISC і слугує «еталоном»: усі РНК із цією послідовністю руйнуються.

Сайленсинг (RNAi). Уперше виявлено на петунії (вимкнення 35S-конструкції; петунія бореться з петувірусами, тому система розвинена). Небажана РНК ріжеться на фрагменти 21–23 нт, що взаємодіють з RISC (компоненти — Dicer, Argonaute); запускається деградація; siRNA переносяться плазмодесмами в сусідні клітини → сайленсингом охоплюються цілі органи/рослина; також діють на рівні ДНК (метилювання, ремоделювання хроматину). Сучасна конструкція: кодувальна частина + інвертований повтор у кінці → шпилька на 3′-кінці → ріжеться на siRNA → власна система запускає сайленсинг (знижує експресію, часто не до нуля). Приклади: сайленсинг AG → махрові квітки; сайленсинг каротиноїд-диоксигеназ у «білої» хризантеми → проявляється накопичення каротиноїдів. РНК-пестициди: siRNA/dsRNA проти специфічних генів шкідника (субодиниця протеасоми, тубулін, гени линяння комах) — ціль має бути видоспецифічною, без гомології з корисними комахами, рибами, людиною. Проблеми: стабілізація РНК у природі, проникнення; частина комах уже стійка (РНК перетравлюється в кишківнику).

Дегрони прибирають уже синтезований білок. Приклад з фізіології рослин — деградація Aux/IAA: у присутності ауксину домен (degron) Aux/IAA впізнається убіквітин-лігазою SCF^TIR1 (F-box білок TIR1 — рецептор ауксину) → убіквітинування → протеасома. До цільового білка пришивають degron Aux/IAA → він деградує за наявності ауксину.

• Приклад: degron + Venus (швидкодозрівальний YFP): з ауксином швидко зникає; стабілізований degron (контроль) не деградує навіть через 120 хв.
• У гетерологічних системах (дріжджі, тварини) TIR1 позбавляють NLS і модифікують під синтетичний ауксин (ніша для об'ємного замісника) → індукція модифікованою молекулою.
• Загальний прийом: химера dCas9 + degron + репресор/ремоделер хроматину → транскрипцію будь-якого гена роблять залежною від ауксину (чи іншого гормону). З ауксином репресорна конструкція деградує → Venus «розгоряється».
• Замінюючи degron, стежать за концентрацією гіберелінів чи жасмонатів (біосенсори): напр., ядра зародка/ендосперму, на які діяв гіберелін, жовтіють; поранення → поширення жасмонатного сигналу по листку.

Аблація (нім. Ablast) — орган закладається, але рано відмирає («генетична хірургія»). Використовують гени токсинів:

• DTA (A-субодиниця дифтерійного токсину) під тканиноспецифічним промотором. Приклад: pLEAFY::DTA → квітки відмирають на ранніх етапах. Незворотно.
• Система Barnase/Barstar (Bacillus amyloliquefaciens): барназа — секретована РНКаза («молекулярна зброя»), барстар — білок-інгібітор, що закриває її активний центр (зв'язування дуже міцне, використовується й у наноматеріалах). Два гени: барназа — для аблації, барстар — для скасування.
  • Чоловіча стерильність: промотор гена тапетуму (з гороху) + барназа → перенесено в пеларгонію: відмирають лише тканини пиляка, тичинкова нитка ціла. Відновлення фертильності: барстар під тим самим/35S-промотором. Лінія А (барназа) × лінія-відновник (Rf, барстар) → у нащадків F1 барназа + барстар «склеюються», РНКаза вимикається, клітини живі. Важливо для виробництва гібридів F1.

Генетичний «термінатор» (патентний захист сортів). Каскад: tet-індукований активатор → при обробці тетрацикліном рекомбіназа видаляє спейсер → промотор пізнього ембріогенезу вмикає білок, що інгібує рибосоми (RIP) → зародок у вже сформованому насінні гине. До продажу насіння обробляють тетрацикліном → зібраний фермером урожай має мертві зародки й не проростає. Викликає етичні заперечення (доступність продовольства для країн, що розвиваються).

CRISPR/Cas. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — бактеріальна «молекулярна пам'ять» про віруси; білок Cas (напр., Cas9) + гідова РНК (gRNA) з ділянкою гомології знаходить ціль і вносить дволанцюговий розріз. У консервативну частину можна вставити будь-яку послідовність → націлювання на будь-яке місце геному. Після редагування конструкцію Cas/CRISPR видаляють схрещуванням → лишається тільки відредагований геном (часто не відрізнити від звичайного сорту).

Інші нуклеази (до CRISPR):

• ZFN (цинкові-пальцеві нуклеази): тандем Zn-пальців (кожен впізнає триплет) + неспецифічна нуклеаза (FokI). Складні в збиранні й тестуванні (білок-ДНК взаємодія, можливі помилки) → не набули поширення.
• TALEN: повтори, кожен впізнає свій нуклеотид + FokI. Теж складні.

Репарація розривів у рослин:

• переважно негомологічне з'єднання кінців (NHEJ) — втрати/вставки нуклеотидів → зсув рамки, стоп-кодони → нокаут гена;
• гомологічна репарація (HDR) рідкісніша → для неї підвищують копійність донорної ДНК з гомологічними плечима (гемінівірусні репликони, генна гармата) → нокін (knock-in): вставка нової послідовності.

Можливості CRISPR:

• нокаут: gRNA до цільового гена → розрізи → NHEJ → мутація (прицільно, на відміну від хімічного/радіаційного мутагенезу);
• нокін: два gRNA (вирізання ділянки) + донорна ДНК з плечима гомології → HDR;
• dCas9 (дефектна, без нуклеазної активності) як платформа: + активатор ФТ (вмикання гена), + репресор/ремоделер хроматину (вимикання), + флуоресцентний білок (візуалізація локусів у хромосомах), + ферменти;
• редактори основ (base editing): dCas9/nCas9 + цитидиндезаміназа (C→U→ пара G·C → A·T) або аденіндезаміназа (A→I→ пара A·T → G·C) → прицільна заміна однієї пари основ без дволанцюгового розриву.

Нокаут/нокін для спрямування метаболізму до цільового продукту:

• зняти негативний зворотний зв'язок (нокаут месенджера, що інгібує фермент);
• зняти транскрипційне інгібування ферменту (нокаут ФТ-репресора) або надекспресія ферменту;
• вимкнути конкурентну гілку (нокаут непотрібного ферменту; miRNA/сайленсинг);
• математичні моделі (диференціальні рівняння швидкостей переходів з урахуванням активації/інгібування та зворотних зв'язків). У прокаріотів інженерія метаболізму працює чудово; у рослин через складність регуляції — скромніше, але успіхи є (вторинні метаболіти, лікарські сполуки).

Модельна система — каротиноїди томата. Фітоєн → лікопін (червоний) → (β-/ε-цикл) → α-/β-каротин → ксантофіли (зеаксантин ⇄ антераксантин ⇄ віолаксантин).

• ген каротиноїд-ізомерази (CRTISO); мутант tangerine (tan) (помаранчевий, накопичує пролікопін замість лікопіну; жовтіє листя, бляклі квітки);
• при достиганні вимикаються β-циклаза та гідроксилаза (β-каротин→ксантофіли) → у плоді переважає лікопін;
• проєкт «Xantomato»: інженерія, щоб гідроксилаза не вимикалася при достиганні → томат, збагачений ксантофілами (антиоксиданти, користь для зору) і β-каротином;
• виправлення мутації: гемінівірусний реплікон + CRISPR надрізає дефектний алель tan → HDR вставляє нормальний фрагмент CRTISO → помаранчеві томати знову стають червоними (демонстрація: редагування не лише ламає, а й виправляє гени).

Підсумок: методичний арсенал молекулярної біології рослин постійно оновлюється; багато підходів приходить з інших систем. Повний огляд неможливий, але основні принципи — інсерційний мутагенез, промоторно-репортерний аналіз, ектопічна/індукована експресія, сайленсинг, дегрони, аблація та редагування геному — дають базу для досліджень і практичних результатів.

Позиційна інформація — клітина «розуміє» своє розташування в організмі завдяки позиційним сигналам. Є клітини-джерела сигналу й клітини-отримувачі, що залежно від отриманої інформації розвивають ту чи іншу структуру.

Модель «французького прапора» (Льюїс Вольперт, L. Wolpert, 1969). Ряд недиференційованих клітин оцінює концентрацію морфогену, що дифундує від джерела й розпадається/поглинається:

• висока концентрація (поріг 1) → «червоний»;
• середня → «жовтий»;
• нижче порога → «синій». Регулюючи чутливість до одного й того ж морфогену, з ряду клітин роблять кілька диференційованих зон (не лише три).

Експерименти Вольперта з куркою. У бруньці крила курки є зона поляризувальної активності (ZPA) ближче до хвостового краю: її опромінення вбиває клітини → зникають пальці (слабша доза — зникає палець 4, середня — ще й 3, лишається 2; сильна — усі). Пересадка другої ZPA симетрично → подвоєння набору пальців (дзеркально). Хімічний морфоген ZPA — ретиноєва кислота (каротиноїдна природа): її градієнт задає «номер» пальця. Той самий морфоген використовується багаторазово — напр., градієнт ретиноєвої кислоти «голова→хвіст» задає відділи хребта.

Потенційні джерела позиційного сигналу в рослин (мають точки синтезу, поширюються, а мутації в них порушують морфогенез):

• фітогормони — низькомолекулярні, мають точки синтезу й поширюються; фізіологічна відповідь залежить від позиції клітини;
• мікроРНК — рухаються плазмодесмами, вимикають гени-мішені (сайленсинг) → позиційний сигнал;
• короткі пептиди — рухаються переважно апопластом (виділяються з клітин); деякі одразу закодовані коротко, інші дозрівають із пропептидів;
• рухливі фактори транскрипції — місце синтезу ≠ місце дії; найвідоміше — родина WOX; також KNOX, HD-ZIP; рухаються плазмодесмами;
• олігосахаридні сигнали — фрагменти клітинної стінки задають полярність клітини.

Родина CLE (назва від CLV3 + ESR-related). В арабідопсису понад 30 генів, подібних між собою.

• Синтез як пре-пропептиду: сигнальна послідовність → просвіт ЕПР → видалення сигнального пептиду → модифікації пропептиду (гідроксилювання проліну, глікозилювання) → протеоліз → зрілий короткий пептид → секреція. Порушення будь-якого етапу → збій сигналу (мутації).
• 2010 р.: усі CLE-білки арабідопсису досліджено репортером GUS — дуже складні патерни експресії (базальна частина листка, жилки, продихи, прилистки, апекс, квітки, стручки, кінчик кореня тощо).
• Нокаути часто не мають фенотипу через функціональне дублювання (пептиди схожі, взаємозамінні); фенотип виявляється лише там, де діє єдиний CLE.

Рецептори CLE — LRR-рецепторні кінази (із лейцин-збагаченим повтором): екстрацелюлярний LRR-домен зв'язує CLE (у димерній формі, необоротно → після зв'язування рецептор деградує). Приклад: CLV1 зв'язує CLV3 (увага: гени CLAVATA з різними номерами належать до різних родин — CLV1 кіназа, CLV3 пептид). Аналогія з афінною хроматографією: пептиди «розсідаються» на рецепторах → концентрація падає з відстанню від джерела.

Система TDIF/TDR (три типи диференціювання, як «французький прапор»). У культурі клітин цинії (що переходять до диференціювання судин ксилеми) виявлено пептид TDIF (Tracheary Element Differentiation Inhibitory Factor) — CLE-пептид, що гальмує диференціювання ксилеми:

• багато TDIF → клітини «думають», що близько до флоемного полюса → флоема;
• середня доза → прокамбій → камбій;
• підпорогова (мало TDIF) → ксилема. Рецептор — TDR/PXY (мутант pxy — перервані судини й флоема, бо клітини не відчувають рівня сигналу). Сигнал передається на WOX4 (і WOX14): експресується в прокамбії, має позитивний зворотний зв'язок, запускає поділ → камбій. Експресія CLE сама під гормональним контролем (вмикається цитокініном) → сигнальний каскад.

Інженерні експерименти (підтверджують позиційну модель): посилення сигналу (35S::TDIF), інверсія сигналу (TDIF під промотором целюлозосинтази IRX3, що вмикається при диференціюванні ксилеми → «ксилема тане, як цукор»), посилення флоемного сигналу (промотор сахарозосинтази) → уся система зсувається від флоемного полюса.

WOX (WUSCHEL-related homeobox) — гомеобокс-гени недиференційованих клітин. В арабідопсису ~15 генів, 3 клади:

• сучасна (WUS, WOX1–7) — лише у квіткових;
• проміжна (WOX8, 9, 11, 12) — у т. ч. у голонасінних;
• давня (WOX10, 13, 14) — у зелених водоростей, мохів, папоротей.

Контур WUS–CLV3 у меристемі пагона (SAM). Меристема поділена на шари:

• у ~3-му шарі експресується WUS; білок рухається плазмодесмами в поверхневий шар, де в ядрі вмикає CLV3;
• CLV3 дозріває, секретується й дифундує вглиб; у 2-му шарі рецепторні кінази (CLV1, CLV2/CORYNE комплекси) виловлюють CLV3 (знижують концентрацію, «не передаючи сигнал у ядро»);
• частина CLV3 доходить до клітин WUS → негативний зворотний зв'язок: CLV3 через рецептори знижує експресію WUS. Автоколивальний контур підтримує сталий розмір меристеми. Порушення (напр., синтезу CLV3) → меристема «не відчуває» кількості клітин → розростання центральної зони → фасціація (сильно витягнута, «гребінчаста» меристема; типово для складноцвітих).

Продихи — позиційний контроль у межах одного шару. У дикого типу продихи не торкаються один одного (правило «одна клітина між продихами»). Мутант tmm (TOO MANY MOUTHS) — продихи контактують; причина — LRR-рецепторна кіназа TMM. Її ліганд — цистеїн-збагачений пептид STOMAGEN/EPF (не CLE). Сигнал іде на bHLH-фактор SPEECHLESS (SPCH) → перемикання на продиховий чи звичайний епідермальний шлях; взаємодія пептиду з TMM «вимикає» продихи в сусідстві.

Модель активатора–інгібітора (Gierer–Meinhardt; на гідрі). Гідра: активатор голови (коротка дистанція, довгоживучий) + інгібітор голови (далі діє, коротше живе), щоб не виникла друга голова (мутанти з багатьма головами → ідентифікація інгібітора). У рослин ролі грають рухливі фактори транскрипції:

• TTG1 (WD40) активує GL1 (MYB) → клітина йде у трихому; разом з GL3 (bHLH) посилюють одне одного;
• трихома виділяє TRY (TRIPTYCHON) — інгібітор, що поширюється на сусідні клітини й пригнічує там розвиток волосків → трихоми розставлені. Мутант gl1 (немає активатора) — немає трихом; мутант try (немає інгібітора) — «гнізда» трихом; подвійний мутант двох інгібіторів — великі острівці волосків.

Закладання бічних органів через потоки ауксину. Клітини епідермісу спрямовують транспорт ауксину (білки PIN) одна до одної → утворюється локальний максимум ауксину → «ініцій» нового примордія. Потужні потоки «диригують» слабшими (басейн збору ауксину). Доказ: мутант pin1 / pinoid (PIN-FORMED) — «шпилькоподібне» безлисте стебло: активного транспорту ауксину немає → немає локальних максимумів → немає бічних органів (меристема росте, але органів не закладає).

Постулати моделі філотаксису (поле інгібування). Класична модель (Hofmeister, Snow & Snow, Douady & Couder) спирається на прості правила:

• новий примордій закладається в кільцевій зоні апекса там, де «заборона» найслабша;
• меристема росте, тож раніше закладені примордії віддаляються від центру, а їхній вплив слабшає;
• кожен примордій створює навколо себе зону інгібування (молекулярна основа — відтік ауксину в примордій і збіднення на ауксин його сусідів);
• щойно в кільці з'являється достатньо «вільного» місця, виникає наступний примордій.

Типи філотаксису залежать від розміру зони інгібування відносно меристеми (у моделі Douady–Couder — від одного безрозмірного параметра):

• велика зона інгібування → дистихія (дворядне розташування, кут 180°);
• менша зона → спіральний філотаксис (кут між послідовними листками наближається до «золотого» ≈ 137,5°, числа парастіх — члени ряду Фібоначчі);
• ще менша зона → супротивне (пари листків, кожна наступна повернута на 90°);
• найменша зона → кільчасте (мутовчасте) розташування — 3, 4, 5… органів у вузлі.

Мірність квітки (квітка — видозмінений пагін): кількість органів у колі значною мірою залежить від геометрії — скільки примордіїв вміщується на колі апекса за даного розміру зони інгібування. Звідси тримерні квітки однодольних (традесканція, лілійник, тюльпан), тетра- та пентамерні квітки дводольних і проміжні випадки, коли між колами «не вистачає» одного органа.

Ускладнення квітки. Махрові форми (додаткові кола оцвітини, як у махрового нарциса) виникають, коли змінюється ідентичність і кількість органів — наприклад, у мутантів ag (див. розділ 5.8).

Будова квітки. Квітка хрестоцвітих (арабідопсис) складається з чотирьох кіл (вертикалів): 4 чашолистки, 4 пелюстки, 6 тичинок (2 коротких + 4 довгих) і гінецей із двох зрослих плодолистків. Така мінімальна схема дуже стала: число органів у колах майже не варіює, тому квітка — зручний об'єкт для генетичного аналізу.

ABC-модель (Coen & Meyerowitz, 1991) пояснює ідентичність органів комбінацією трьох функцій:

• клас A (APETALA1, APETALA2) — вертикали 1–2; клас B (APETALA3, PISTILLATA) — вертикали 2–3; клас C (AGAMOUS) — вертикали 3–4; функції A і C взаємно пригнічують одна одну;
• A → чашолистки; A + B → пелюстки; B + C → тичинки; C → плодолистки;
• для роботи B- і C-білків потрібні також гени SEPALLATA (SEP1–4): MADS-білки утворюють тетрамерні комплекси («квартети») на ДНК.

Передбачення моделі, перевірені на мутантах.

• ap2 (немає A): послідовність органів «плодолисток – тичинка – тичинка – плодолисток»;
• ap3 або pi (немає B): «чашолисток – чашолисток – плодолисток – плодолисток»;
• ag (немає C): «чашолисток – пелюстка – пелюстка – нова квітка» (квітка втрачає детермінованість і росте повторно);
• потрійний мутант sep1 sep2 sep3: усі вертикали утворюють чашолисткоподібні органи; у sep1 sep2 sep3 sep4 — листкоподібні;
• ектопічна експресія AP3 + PI + AP1 + SEP3 перетворює листки на пелюстки, а AP3 + PI + AG + SEP3 — на тичинки.

Стійкість моделі. Мережу взаємодій генів ідентичності органів описують булевою моделлю: кожен ген — вузол зі станами «вимкнено/увімкнено», правила задають, як стан гена залежить від інших. Починаючи від різних початкових станів, мережа сходиться до невеликого числа стійких станів (атракторів), кожен із яких відповідає профілю експресії певного типу клітин: чашолистка, пелюстки, тичинки, плодолистка або клітин суцвіття. Ці стани зберігаються за невеликих збурень — модель робастна й відтворює експериментальні дані без підгонки параметрів.

Моделі як інструмент прогнозу. Якщо модель добре описує норму, її можна «зламати» на комп'ютері й порівняти із живою рослиною:

• ABC-модель передбачила, що ектопічна експресія гена класу B у першому вертикалі (де діє A) дасть пелюстки, а у четвертому (де діє C) — тичинки; саме це спостерігали у рослин, що несуть AP3 та PI під конститутивним промотором;
• булева мережа передбачає, які подвійні та потрійні мутанти мають існувати, і які комбінації втрат функції призводять до «квітки-листка»;
• еволюційні варіації. У тюльпана й лілії зовнішнє коло (чашолистки) за формою й забарвленням нагадує пелюстки (tepals), бо гени класу B експресуються й у першому вертикалі — це «зсув межі» домену B, що пояснюють модифікованою ABC-моделлю. Аналогічні відхилення відомі в базальних покритонасінних.

Аномалії числа органів. Збільшення кількості органів, фасціація й додаткові кола (наприклад, у мутантів clavata із збільшеною меристемою) пов'язані не з ідентичністю органів, а з розміром меристеми та контуром WUS–CLV3 (розділ 5.5).

Математичні й логічні моделі дозволяють:

• пояснювати, як із однорідних клітин виникають патерни (градієнти морфогенів, активатор–інгібітор, поле інгібування);
• передбачати наслідки мутацій і ектопічної експресії, а отже планувати експерименти; сьогодні такі прогнози перевіряють редагуванням геному (CRISPR/Cas);
• виявляти неповноту знань: якщо модель не відтворює спостережуване, бракує істотного компонента (наприклад, механічних сил у рості тканин);
• описувати еволюційні переходи (зміна кількості й ідентичності органів) через зміну параметрів чи доменів експресії генів.