ЛР 3. Кислотно-основні властивості амінокислот

01Мета і план

Мета

Вивчити амфотерні властивості амінокислот, навчитися визначати за кривою титрування значення pK_a іоногенних груп та ізоелектричну точку (pI) і за ними ідентифікувати амінокислоту.

Ви навчитеся

читати криву титрування і знаходити точки напівнейтралізації;
розраховувати pI для нейтральних, кислих і основних амінокислот;
пояснювати буферні властивості амінокислот і білків.

Знадобиться

Калькулятор або Excel, бланк звіту, міліметровий папір для побудови кривої титрування.

02Теоретичні відомості

Амінокислоти — амфотерні сполуки

Кожна α-амінокислота містить щонайменше дві іоногенні групи: карбоксильну (–COOH, слабка кислота) та аміногрупу (–NH₃⁺, кислота, спряжена зі слабкою основою). У розчині за фізіологічних pH амінокислота існує переважно у формі цвітер-іона ⁺H₃N–CHR–COO⁻. Під час титрування лугом протони відщеплюються послідовно — спершу від карбоксильної групи, потім від аміногрупи:

{H_{3} N}^{+} - CHR - COOH \overset{p K_{1}}{⇌} {H_{3} N}^{+} - CHR - {COO}^{-} \overset{p K_{2}}{⇌} H_{2} N - CHR - {COO}^{-}

(1)

Рівняння Гендерсона–Гассельбаха

Співвідношення депротонованої (A⁻) і протонованої (HA) форм кожної групи визначає pH розчину:

pH = p K_{a} + \lg \frac{[A^{-}]}{[HA]}

(2)

Коли половину групи нейтралізовано ([A⁻] = [HA]), pH = pK_a. Тому на кривій титрування значення pK_a відповідають точкам напівнейтралізації — 0,5; 1,5; 2,5 еквівалента лугу. Поблизу цих точок крива найпологіша: тут розчин має найбільшу буферну ємність (±1 одиниця pH навколо pK_a).

Частку дисоційованої форми групи з константою K_a описує вираз, з якого будується вся крива титрування:

α = \frac{1}{1 + 10^{p K_{a} - pH}},

(3)

n — середня кількість відщеплених протонів на молекулу; саме її ми відкладаємо по осі абсцис як кількість еквівалентів доданого лугу.

Ізоелектрична точка

Ізоелектрична точка (pI) — значення pH, за якого сумарний заряд молекули дорівнює нулю. В електричному полі амінокислота в pI не рухається, а розчинність білків у pI мінімальна (на цьому ґрунтується ізоелектричне осадження). pI дорівнює середньому арифметичному двох pK_a, що «оточують» нейтральну форму:

pI = \frac{p K_{1} + p K_{2}}{2}

(4)

Кислі амінокислоти (аспарагінова, глутамінова) мають додаткову карбоксильну групу в радикалі й pI ≈ 3; основні (лізин, аргінін, гістидин) — додаткову аміногрупу або гуанідинову/імідазольну групу й pI ≈ 7,6–10,8. Кількість ступенів на кривій титрування дорівнює кількості іоногенних груп.

Значення для рослинної клітини

Іоногенні групи амінокислотних залишків визначають заряд і конформацію білків, а отже — роботу ферментів (див. ЛР 2: pH-оптимум). Вільні амінокислоти та білки цитоплазми є буферною системою, що разом із фосфатною підтримує pH цитозолю ≈ 7,2–7,5. Гістидин (pK_R ≈ 6,0) — найкращий буфер у фізіологічному діапазоні, а його імідазольна група часто бере участь у кислотно-основному каталізі.

03Інтерактивна модель

Оберіть амінокислоту або задайте власні pK_a. Ліворуч — крива титрування лугом (pH від кількості еквівалентів NaOH), праворуч — сумарний заряд молекули залежно від pH.

Амінокислота

Для «нейтральних» амінокислот третя група відсутня. Значення pK_a — довідкові, для 25 °C.

Крива титрування

Сумарний заряд від pH

Ізоелектрична точка pI

—

Заряд при pH 7,4

—

Іоногенних груп

—

Буферні зони (pK ± 1)

—

04Віртуальний експеримент

Вам видано 20 мл 0,05 М розчину невідомої амінокислоти у формі гідрохлориду (усі групи протоновані). Розчин титрують 0,1 М NaOH, вимірюючи pH після кожної порції лугу. Побудуйте криву титрування, визначте pK_a, pI та встановіть, яка це амінокислота.

Ваш варіант

Прізвище або номер у журналі.

Варіант

05Завдання для звіту

У моделі порівняйте криві титрування гліцину, глутамінової кислоти та лізину. Скільки ступенів має кожна крива і чому?
Для гістидину визначте за моделлю заряд при pH 5, 7,4 і 9. Поясніть, чому гістидин — важливий буфер у клітині.
За даними експерименту побудуйте криву титрування: pH від об'єму NaOH (мл) і від кількості еквівалентів (1 еквівалент = 10 мл 0,1 М NaOH на 1 ммоль амінокислоти).
Знайдіть точки напівнейтралізації (0,5; 1,5; 2,5 екв.) і визначте за ними pK_a. Для уточнення можна побудувати похідну ΔpH/ΔV: pK відповідають її мінімумам, точки еквівалентності — максимумам. Зверніть увагу: для дуже кислої групи (pK_a < 3) значна частина доданого лугу витрачається на нейтралізацію вільних іонів H⁺, тому pH у точці напівнейтралізації вищий за pK_a на 0,1–0,3.
Розрахуйте pI за формулою (4), визначте амінокислоту за довідковими pK_a і запишіть рівняння дисоціації її груп.

06Контрольні питання

Чому амінокислоти називають амфотерними сполуками?

Вони містять кислотні (–COOH) та основні (–NH₂) групи, тому можуть як віддавати, так і приєднувати протони, реагуючи і з кислотами, і з лугами.

Що таке цвітер-іон?

Біполярний іон ⁺H₃N–CHR–COO⁻, що має одночасно позитивний і негативний заряди; у ньому амінокислота переважно перебуває в нейтральних розчинах.

Як визначити pK_a за кривою титрування?

pK_a дорівнює pH у точці напівнейтралізації відповідної групи (0,5; 1,5; 2,5 еквівалента лугу), де концентрації протонованої і депротонованої форм рівні.

Чому білки найгірше розчиняються в ізоелектричній точці?

У pI сумарний заряд молекул дорівнює нулю, електростатичне відштовхування між ними зникає, і молекули легше агрегують та випадають в осад.

Яка амінокислота є найкращим буфером при pH 7? Чому?

Гістидин: pK_a імідазольної групи ≈ 6,0, тож поблизу нейтральних pH у розчині є помітні кількості обох форм цієї групи.

07Література

Nelson D. L., Cox M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 8th ed. New York : W. H. Freeman, 2021. Ch. 3.
Berg J. M., Tymoczko J. L., Gatto G. J., Stryer L. Biochemistry. 9th ed. New York : W. H. Freeman, 2019. Ch. 2.
Губський Ю. І. Біологічна хімія : підручник. 2-ге вид. Вінниця : Нова Книга, 2009.
Buchanan B. B., Gruissem W., Jones R. L. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. 2nd ed. Wiley-Blackwell, 2015. Ch. 7.

← ЛР 2. Температура і pH ЛР 4. Білок за Бредфорд →

Кислотно-основні властивості амінокислот