Кафедра ФБРтаБ Фізіологія, біохімія рослин та біоенергетика · НУБіП України
Бета-версія
Лабораторна робота № 4

Кількісне визначення білка методом Бредфорд

Калібрувальна крива, метод найменших квадратів і перерахунок на масу сирої речовини: як отримати мг білка на грам листка.

БіохіміяБілкиФотометрія≈ 90 хвилин

01Мета і план

Мета

Опанувати спектрофотометричне визначення білка методом Бредфорд: побудувати калібрувальну криву, знайти концентрацію білка в екстракті та розрахувати його вміст у рослинному матеріалі.

Ви навчитеся

  • будувати калібрувальну пряму методом найменших квадратів;
  • оцінювати межі лінійності методу і правильно розводити проби;
  • перераховувати концентрацію в пробі на вміст у тканині (мг/г).

Знадобиться

Калькулятор або Excel, бланк звіту.

02Теоретичні відомості

Принцип методу

Барвник Кумасі діамантовий синій G-250 у кислому розчині існує переважно в червоно-коричневій катіонній формі з максимумом поглинання ≈ 465 нм. Зв'язуючись із білком — передусім із залишками аргініну, лізину та гістидину й гідрофобними ділянками, — він переходить у стабільну аніонну синю форму з максимумом поглинання 595 нм. Інтенсивність синього забарвлення пропорційна кількості білка в пробі. Реакція відбувається за 2–5 хв, а забарвлення стабільне близько години.

Метод запропонувала М. Бредфорд у 1976 р. Він швидкий і чутливий (1–20 мкг білка в пробі в мікроваріанті), мало залежить від присутності сахарів і солей, але дещо порушується детергентами та сильно лужними буферами.

Закон Бугера–Ламберта–Бера і калібрування

Оптична густина (поглинання) розчину пропорційна концентрації поглинаючої речовини та товщині шару:

A=lgI0I=ε·c·l (1)

Для комплексу білок–барвник ε залежить від амінокислотного складу білка, тому абсолютне значення ε не використовують. Натомість будують калібрувальну криву за стандартним білком — зазвичай бичачим сироватковим альбуміном (БСА) — і знаходять рівняння прямої методом найменших квадратів:

A=a+b·c,b=∑(ci−c‾)(Ai−A‾)∑(ci−c‾)2,a=A‾−bc‾ (2)

Концентрацію білка в досліджуваній пробі знаходять з рівняння прямої: c = (A − a)/b.

Межі лінійності

Кількість барвника в реагенті обмежена, тож за високих концентрацій білка калібрувальна крива вигинається й наближається до насичення. У моделі це описано гіперболою:

A(c)=Amax·cKs+c (3)

Для c ≪ Ks крива майже лінійна з нахилом Amax/Ks. Якщо пряму провести через стандарти до надто високих концентрацій, вона «недооцінить» малі проби й «переоцінить» великі. Тому проби розводять так, щоб їхнє поглинання потрапляло в середину лінійної ділянки (у класичному варіанті — 0,1–1,0 мг/мл БСА).

Розрахунок вмісту білка в тканині

W=c·d·Vекстрm (4)

W — вміст білка, мг/г сирої маси; c — концентрація білка в розведеній пробі, мг/мл; d — кратність розведення екстракту; Vекстр — об'єм екстракту, мл; m — наважка листків, г.

Розчинні білки листка становлять 10–25 мг/г сирої маси, з них до половини припадає на один фермент — Рубіско, найпоширеніший білок на Землі. Вміст білка зменшується зі старінням листка та за нестачі азоту.

03Інтерактивна модель

Модель показує справжню (нелінійну) залежність поглинання від концентрації білка і пряму, проведену через стандарти. Змінюйте найбільшу концентрацію стандарту й концентрацію проби: подивіться, коли лінійне калібрування починає помилятися.

Калібрування

Проба

Калібрувальна крива (A595 від концентрації БСА)

A595 проби
—
Рівняння прямої
—
c за калібруванням
—
Похибка калібрування
—

04Віртуальний експеримент

Наважку свіжих листків розтерли з буфером, екстракт відцентрифугували й розвели. До 0,1 мл кожного стандарту БСА та розведеного екстракту додали по 5 мл реагенту Бредфорд і через 5 хв виміряли A595 проти холостої проби. Побудуйте калібрувальну пряму та розрахуйте вміст розчинного білка в листках.

Ваш варіант

Прізвище або номер у журналі.

05Завдання для звіту

  1. У моделі встановіть найбільший стандарт 0,5 мг/мл, потім 2 мг/мл. Як змінилися нахил прямої й похибка для проби 0,3 мг/мл? Поясніть за рівнянням (3).
  2. Знайдіть за моделлю концентрацію проби, вище якої похибка лінійного калібрування перевищує 5 % (найбільший стандарт — 1 мг/мл).
  3. За даними експерименту побудуйте калібрувальний графік і методом найменших квадратів знайдіть a, b та R2.
  4. Обчисліть середнє поглинання паралельних проб екстракту та концентрацію білка в розведеній пробі.
  5. Розрахуйте вміст розчинного білка в листках (мг/г сирої маси) за формулою (4) і порівняйте з типовими значеннями.

06Контрольні питання

На чому ґрунтується метод Бредфорд?
На зв'язуванні барвника Кумасі синього G-250 з білками в кислому середовищі: барвник переходить у синю аніонну форму з максимумом поглинання 595 нм, інтенсивність якої пропорційна кількості білка.
Навіщо будують калібрувальну криву?
Поглинання комплексу барвник–білок залежить від амінокислотного складу білка, тому його порівнюють зі стандартним білком (БСА) відомих концентрацій.
Чому калібрувальна крива на високих концентраціях вигинається?
Кількість барвника в реагенті обмежена: що більше білка, то менша частка вільного барвника, і приріст поглинання сповільнюється (насичення).
Чому пробу іноді треба розвести?
Щоб поглинання потрапило в лінійну ділянку калібрувальної кривої, де розрахунок за рівнянням прямої точний.
Який білок переважає серед розчинних білків листка?
Рибулозобісфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (Рубіско) — до 50 % розчинного білка хлоропластів.

07Література

  1. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248–254.
  2. Kruger N. J. The Bradford method for protein quantitation. In: Walker J. M. (ed.) The Protein Protocols Handbook. Totowa : Humana Press, 2009. P. 17–24.
  3. Мусієнко М. М., Паршикова Т. В., Славний П. С. Спектрофотометричні методи в практиці фізіології, біохімії та екології рослин. Київ : Фітосоціоцентр, 2001.
  4. Taiz L., Zeiger E., Møller I. M., Murphy A. Plant Physiology and Development. 6th ed. Sunderland : Sinauer Associates, 2015.
← ЛР 3. Амінокислоти ЛР 5. Пігменти пластид →