ЛР 5. Спектрофотометричне визначення хлорофілів і каротиноїдів

01Мета і план

Мета

Опанувати спектрофотометричний метод визначення пігментів пластид в ацетоновій витяжці: розрахувати концентрації хлорофілів a, b і суми каротиноїдів, їхній вміст у листках і співвідношення хлорофілів a/b.

Ви навчитеся

пояснювати форму спектрів поглинання пігментів;
застосовувати закон Бугера–Ламберта–Бера до суміші речовин;
розраховувати вміст пігментів на одиницю маси листка і порівнювати світлові й тіньові листки.

Знадобиться

Калькулятор або Excel, бланк звіту.

02Теоретичні відомості

Пігменти пластид

У тилакоїдах хлоропластів містяться хлорофіли a і b та каротиноїди (каротини й ксантофіли). Хлорофіл a входить до реакційних центрів фотосистем, хлорофіл b і каротиноїди — допоміжні пігменти світлозбиральних комплексів, а каротиноїди ще й захищають фотосинтетичний апарат від фотоокиснення. Хлорофіли мають два максимуми поглинання — у синій (≈ 430–455 нм) і червоній (≈ 640–665 нм) ділянках спектра; каротиноїди поглинають лише синьо-зелене світло (400–500 нм).

Закон Бугера–Ламберта–Бера для суміші

Якщо пігменти не взаємодіють, оптичні густини складаються:

A_{λ} = l \cdot \sum_{i} α_{i, λ} c_{i}

(1)

α_i,λ — питомий коефіцієнт поглинання пігменту i на довжині хвилі λ, мл/(мкг·см); c_i — концентрація, мкг/мл; l — товщина шару, 1 см.

Вимірявши поглинання на двох довжинах хвиль — у червоних максимумах хлорофілу a (663 нм) і хлорофілу b (646 нм), — отримуємо систему двох рівнянь із двома невідомими. Її розв'язок для 80-відсоткового ацетону дав Г. Ліхтенталер (рівняння Ліхтенталера–Велберна):

\begin{array}{l} C_{a} = 12,21 \cdot A_{663} - 2,81 \cdot A_{646} \\ C_{b} = 20,13 \cdot A_{646} - 5,03 \cdot A_{663} \\ C_{x + c} = \frac{1000 \cdot A_{470} - 3,27 \cdot C_{a} - 104 \cdot C_{b}}{198} \end{array}

(2)

Концентрації — у мкг/мл; C_x+c — сума ксантофілів і каротинів. Каротиноїди визначають на 470 нм, де поглинання хлорофілів відносно невелике, але його все одно віднімають (два останні доданки чисельника). Перед розрахунком від усіх значень віднімають поглинання на 720–750 нм, де пігменти не поглинають, — це поправка на каламутність витяжки.

Розрахунок вмісту в листку

W = \frac{C \cdot V \cdot d}{1000 \cdot m}

(3)

W — вміст пігменту, мг/г сирої маси; C — концентрація у витяжці, мкг/мл; V — об'єм витяжки, мл; d — кратність розведення; m — наважка, г.

Співвідношення хлорофілів a/b у світлових листках ≈ 3,0–3,6, у тіньових — 2,2–2,8: за слабкого світла рослина нарощує світлозбиральні комплекси, багаті на хлорофіл b. Співвідношення (a + b)/(x + c) ≈ 4–7; воно знижується за старіння листка та стресу, коли хлорофіли руйнуються швидше за каротиноїди.

Вимірювати треба швидко й у темряві або при слабкому світлі: хлорофіли у витяжці фотоокиснюються, а в кислому середовищі перетворюються на феофітини (див. ЛР 5 і ЛР 12 з фізіології рослин), що спотворює результат.

03Інтерактивна модель

Задайте концентрації пігментів у витяжці (80-відсотковий ацетон, кювета 1 см). Модель складає спектр суміші з спектрів окремих пігментів і показує поглинання на робочих довжинах хвиль. Колір смуги під графіком — колір витяжки, яким його бачить око.

Склад витяжки

Спектр поглинання витяжки

A₄₇₀

—

A₆₄₆

—

A₆₆₃

—

Хл a / Хл b

—

04Віртуальний експеримент

Наважку листків розтерли з CaCO₃ і 80-відсотковим ацетоном, витяжку відфільтрували й довели до певного об'єму, за потреби розвели. Виміряли оптичну густину на 470, 646, 663 і 720 нм у кюветі 1 см. Розрахуйте концентрації та вміст пігментів у листках.

Ваш варіант

Прізвище або номер у журналі.

Варіант

05Завдання для звіту

У моделі порівняйте спектри «Світловий листок» і «Тіньовий листок». На яких довжинах хвиль вони відрізняються найбільше і чому?
Залиште в моделі лише каротиноїди. Якого кольору витяжка і чому каротиноїди не поглинають у червоній ділянці?
За даними експерименту відніміть від A₄₇₀, A₆₄₆ та A₆₆₃ поглинання на 720 нм і розрахуйте C_a, C_b, C_x+c за рівняннями (2).
Перерахуйте концентрації на вміст пігментів у листках (мг/г сирої маси) за формулою (3).
Обчисліть співвідношення a/b та (a + b)/(x + c). Зробіть висновок, світловим чи тіньовим був листок.

06Контрольні питання

Чому хлорофіл зелений?

Він сильно поглинає синє та червоне світло й слабо — зелене (500–600 нм), яке відбивається та пропускається листком.

Навіщо вимірювати поглинання на двох довжинах хвиль для хлорофілів?

Спектри хлорофілів a і b перекриваються, тож кожне значення A містить внесок обох пігментів; два вимірювання дають систему двох рівнянь із двома невідомими концентраціями.

Для чого віднімають поглинання на 720–750 нм?

Пігменти в цій ділянці не поглинають, тому сигнал там — це розсіювання на завислих частинках (каламутність), яке додається до всіх довжин хвиль.

Чому в тіньових листках відношення хлорофілів a/b менше?

За слабкого світла рослина збільшує кількість світлозбиральних комплексів, які містять багато хлорофілу b, щоб уловлювати більше світла.

Чому витяжку не можна залишати на світлі та підкислювати?

На світлі хлорофіли фотоокиснюються, а в кислому середовищі втрачають Mg²⁺ і перетворюються на бурі феофітини з іншим спектром.

07Література

Lichtenthaler H. K., Wellburn A. R. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Biochemical Society Transactions. 1983. Vol. 11. P. 591–592.
Lichtenthaler H. K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology. 1987. Vol. 148. P. 350–382.
Мусієнко М. М., Паршикова Т. В., Славний П. С. Спектрофотометричні методи в практиці фізіології, біохімії та екології рослин. Київ : Фітосоціоцентр, 2001.
Taiz L., Zeiger E., Møller I. M., Murphy A. Plant Physiology and Development. 6th ed. Sunderland : Sinauer Associates, 2015. Ch. 7.

← ЛР 4. Білок за Бредфорд ЛР 6. Амілаза →

Спектрофотометричне визначення хлорофілів і каротиноїдів