Кафедра ФБРтаБ Фізіологія, біохімія рослин та біоенергетика · НУБіП України
Бета-версія
Лабораторна робота № 6

Амілолітична активність проростаючого насіння

Як за зникненням синього йодкрохмального забарвлення виміряти активність амілаз і простежити їхню індукцію під час проростання насіння.

БіохіміяФерментиВуглеводи≈ 90 хвилин

01Мета і план

Мета

Дослідити кінетику гідролізу крохмалю амілазами пророслого насіння, визначити константу швидкості реакції та амілолітичну активність і простежити, як вона змінюється протягом проростання.

Ви навчитеся

  • описувати перебіг ферментативної реакції в часі (криву накопичення / витрачання субстрату);
  • визначати константу швидкості за напівлогарифмічним графіком;
  • пояснювати гормональну регуляцію мобілізації крохмалю в зерновці.

Знадобиться

Калькулятор або Excel, міліметровий папір, бланк звіту.

02Теоретичні відомості

Амілази рослин

Крохмаль ендосперму — головний запас енергії та вуглецю для проростка. Його гідролізують α-амілаза (ендоамілаза, розриває α-1,4-зв'язки всередині ланцюга і швидко зменшує довжину молекул), β-амілаза (екзоамілаза, відщеплює мальтозу з невідновних кінців), а також дебранчинг-ферменти (розривають α-1,6-зв'язки амілопектину) і α-глюкозидаза. Кінцеві продукти — мальтоза та глюкоза, які транспортуються в щиток і далі до зародка.

Гормональна регуляція

У зерновці злаків α-амілаза майже відсутня в сухому насінні й синтезується заново в алейроновому шарі під час проростання. Зародок виділяє гібереліни, які активують транскрипційний фактор GAMYB і синтез α-амілази; фермент секретується в ендосперм. Абсцизова кислота пригнічує цей процес. Тому амілолітична активність зерна зростає протягом перших 3–5 діб проростання в десятки разів. На цьому ґрунтується солодування ячменю.

Йодкрохмальна реакція

Амілоза утворює з йодом комплекс синього кольору (максимум поглинання ≈ 590–620 нм): молекули I3−/I5− розміщуються всередині спіралі. Що коротші ланцюги, то слабше забарвлення: декстрини дають фіолетовий, потім червоно-бурий колір, а мальтоза з йодом не забарвлюється (ахроматична точка). Тому поглинання йодкрохмального комплексу A приблизно пропорційне концентрації залишкового крохмалю.

Кінетика гідролізу

Швидкість реакції описує рівняння Міхаеліса–Ментен (див. ЛР 1). Інтегрувавши його, отримаємо залежність концентрації субстрату від часу:

(S0−S)+KmlnS0S=Vmax·t (1)

Якщо концентрація субстрату значно менша за Km, перший доданок малий, і реакція має перший порядок:

S(t)=S0e−kt,k=VmaxKm,lnA=lnA0−kt,t1/2=ln2k (2)

Константа k пропорційна кількості ферменту (Vmax = kcat·[E]), тож вона є мірою активності екстракту. На графіку ln A від t експериментальні точки лягають на пряму з нахилом −k.

Амілолітична активність

Практично активність виражають кількістю крохмалю, гідролізованого за одиницю часу в розрахунку на масу насіння:

АА=S0·Vр·(1−At/A0)t·mр (3)

АА — мг крохмалю/(хв·г); S0 — початкова концентрація крохмалю, мг/мл; Vр — об'єм реакційної суміші, мл; A0, At — поглинання йодкрохмального комплексу на початку і через час t; mр — маса насіння, що відповідає ферментному екстракту, внесеному в пробу, г.

Формула (3) дає середню активність за час t. Вона близька до початкової швидкості, лише поки гідролізовано не більше ніж 30–40 % крохмалю; за довшої інкубації реакція сповільнюється через зменшення концентрації субстрату.

03Інтерактивна модель

Модель розв'язує інтегроване рівняння Міхаеліса–Ментен (1). Змінюйте кількість ферменту та початкову концентрацію крохмалю. Порівняйте точний розв'язок із наближенням першого порядку (2).

Реакційна суміш

Залишковий крохмаль (A йодкрохмального комплексу)

Напівлогарифмічний графік ln A від t

Початкова швидкість
—
k = Vmax/Km
—
Гідролізовано 50 % за
—
Ахроматична точка (A < 0,05)
—

04Віртуальний експеримент

Зерно пшениці пророщували 0–5 діб. З наважки зерна кожної доби приготували ферментний екстракт; у пробу вносили екстракт, що відповідає певній масі зерна, до 5 мл 1-відсоткового (10 мг/мл) розчину крохмалю при 30 °C. Через певні проміжки часу відбирали аліквоти в розчин йоду й вимірювали A620. Для зерна третьої доби знято повну кінетичну криву; для решти — поглинання на 0-й і 10-й хвилині.

Ваш варіант

Прізвище або номер у журналі.

05Завдання для звіту

  1. У моделі збільште кількість ферменту вдвічі. Як змінилися початкова швидкість, k і час напівгідролізу? Чому?
  2. Встановіть S0 = 2 і 20 мг/мл за однакової кількості ферменту. За якої концентрації наближення першого порядку точніше? Поясніть за рівнянням (1).
  3. За даними кінетики для зерна третьої доби побудуйте графік ln A від t і методом найменших квадратів знайдіть k та t1/2.
  4. За формулою (3) розрахуйте амілолітичну активність зерна кожної доби проростання (t = 10 хв) і побудуйте графік АА від доби.
  5. Визначте добу максимальної активності та у скільки разів вона перевищує активність сухого зерна. Поясніть результат із погляду регуляції гіберелінами.

06Контрольні питання

Чим відрізняються α- і β-амілази?
α-Амілаза — ендофермент: розриває α-1,4-зв'язки всередині ланцюга, швидко зменшуючи його довжину; β-амілаза — екзофермент: послідовно відщеплює мальтозу з невідновних кінців.
Чому синє забарвлення з йодом зникає під час гідролізу крохмалю?
Синій комплекс утворюють лише довгі спіральні ланцюги амілози; продукти гідролізу (короткі декстрини, мальтоза) з йодом синього кольору не дають.
Чому активність амілази в зерні зростає під час проростання?
Гібереліни зародка індукують синтез α-амілази в алейроновому шарі, фермент секретується в ендосперм і мобілізує крохмаль.
Як за графіком ln A від t знайти константу швидкості?
Для реакції першого порядку точки лягають на пряму; її нахил дорівнює −k, а t1/2 = ln 2 / k.
Чому для розрахунку активності беруть короткий час інкубації?
Поки гідролізовано невелику частку крохмалю, концентрація субстрату майже не змінюється і середня швидкість близька до початкової.

07Література

  1. Gubler F., Kalla R., Roberts J. K., Jacobsen J. V. Gibberellin-regulated expression of a myb gene in barley aleurone cells. The Plant Cell. 1995. Vol. 7. P. 1879–1891.
  2. Smith A. M., Zeeman S. C., Smith S. M. Starch degradation. Annual Review of Plant Biology. 2005. Vol. 56. P. 73–98.
  3. Cornish-Bowden A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. 4th ed. Wiley-Blackwell, 2012. Ch. 3.
  4. Мусієнко М. М. Фізіологія рослин : підручник. Київ : Либідь, 2005.
← ЛР 5. Пігменти пластид ЛР 7. Дихальний коефіцієнт →