Кафедра ФБРтаБ Фізіологія, біохімія рослин та біоенергетика · НУБіП України
Бета-версія
Лабораторна робота № 8

Аскорбінова кислота: вміст у рослинах і руйнування під час нагрівання

Титрування за Тільмансом, кінетика першого порядку і рівняння Арреніуса: скільки вітаміну С лишається після варіння.

БіохіміяВітаміниКінетика≈ 90 хвилин

01Мета і план

Мета

Визначити вміст аскорбінової кислоти в рослинному матеріалі методом Тільманса (титруванням 2,6-дихлорфеноліндофенолом), дослідити кінетику її термічного руйнування та розрахувати константи швидкості, період напіврозпаду й енергію активації.

Ви навчитеся

  • розраховувати вміст вітаміну С за результатами титрування;
  • визначати порядок реакції та константу швидкості за напівлогарифмічним графіком;
  • оцінювати енергію активації за константами швидкості при двох температурах.

Знадобиться

Калькулятор або Excel, бланк звіту.

02Теоретичні відомості

Аскорбінова кислота в рослинах

L-аскорбінова кислота (вітамін С, C6H8O6) — найпоширеніший водорозчинний антиоксидант рослинної клітини. Її вміст у листках сягає 1–5 мг/г сирої маси, а найбільше її в плодах шипшини, чорної смородини, солодкого перцю та в капусті. Аскорбат відновлює активні форми кисню (аскорбат-глутатіоновий цикл з аскорбатпероксидазою), регенерує α-токоферол, є кофактором діоксигеназ (синтез гіберелінів, етилену, оксипроліну клітинних стінок) і бере участь у ксантофіловому циклі. Людина аскорбінову кислоту не синтезує, тож рослини — її основне джерело.

Метод Тільманса

Аскорбінова кислота легко окиснюється до дегідроаскорбінової, віддаючи два атоми водню. Окисником слугує барвник 2,6-дихлорфеноліндофенол (ДХФІФ, фарба Тільманса): у нейтральному та лужному середовищі він синій, у кислому — рожево-червоний, а у відновленій формі безбарвний.

АК+ДХФІФ(рожевий)→ДАК+ДХФІФ·H2(безбарвний) (1)

Кислий екстракт (2-відсоткова HCl або метафосфорна кислота стабілізує аскорбат) титрують розчином барвника, доки рожеве забарвлення не триматиметься 30 с. Вміст аскорбінової кислоти розраховують за формулою:

X=V·T·Vекстр·100Vал·m (2)

X — вміст аскорбінової кислоти, мг/100 г; V — об'єм барвника, витрачений на титрування, мл (за вирахуванням холостої проби); T — титр барвника за аскорбіновою кислотою, мг/мл; Vекстр — загальний об'єм екстракту, мл; Vал — об'єм аліквоти, взятої для титрування, мл; m — наважка, г.

Кінетика руйнування

Під час нагрівання аскорбінова кислота окиснюється киснем повітря (каталізатори — іони Cu2+, Fe3+, фермент аскорбатоксидаза) та гідролізується. Руйнування зазвичай добре описує реакція першого порядку:

dCdt=−kC⇒lnC=lnC0−kt,t1/2=ln2k (3)

Оскільки вміст пропорційний об'єму барвника, на графік можна відкладати ln V замість ln C — нахил однаковий.

Залежність константи швидкості від температури описує рівняння Арреніуса (див. ЛР 2). Маючи константи для двох температур, енергію активації знаходять так:

Ea=R·ln(k2/k1)1T1−1T2 (4)

T1, T2 — абсолютні температури, К; R = 8,314 Дж/(моль·К).

Щоб зберегти вітамін С під час кулінарної обробки, овочі кладуть у вже киплячу воду (швидко інактивується аскорбатоксидаза, а з води видалено кисень), варять під кришкою, недовго й у невеликому об'ємі води, не використовують мідний посуд.

03Інтерактивна модель

Модель розраховує руйнування аскорбінової кислоти як реакцію першого порядку з константою, що залежить від температури за Арреніусом. Змінюйте температуру обробки, енергію активації та тривалість.

Умови обробки

Залишок вітаміну С, % від початкового

Період напіврозпаду від температури

k при вибраній T
—
Період напіврозпаду
—
Залишається після обробки
—
Q10 (80→90 °C)
—

04Віртуальний експеримент

Наважку рослинного матеріалу розтерли з 2-відсотковою HCl, довели об'єм екстракту до 100 мл і відфільтрували. Порції екстракту витримували на водяній бані при двох температурах; через певні проміжки часу відбирали аліквоти по 10 мл і титрували розчином ДХФІФ. Об'єми барвника наведено за вирахуванням холостої проби.

Ваш варіант

Прізвище або номер у журналі.

05Завдання для звіту

  1. У моделі визначте, скільки відсотків вітаміну С лишається після 10 і 30 хв обробки при 100 °C (Ea = 60 кДж/моль). Як зміниться результат при 70 °C?
  2. Порівняйте за моделлю періоди напіврозпаду при Ea = 40 і 90 кДж/моль. Чому за більшої Ea руйнування сильніше залежить від температури?
  3. За об'ємом барвника в нульовий момент розрахуйте вміст аскорбінової кислоти в рослинному матеріалі за формулою (2).
  4. Для кожної температури побудуйте графік ln V від t, знайдіть константи швидкості k (як −нахил) і періоди напіврозпаду.
  5. За формулою (4) обчисліть енергію активації руйнування аскорбінової кислоти. Дайте рекомендації щодо кулінарної обробки продукту.

06Контрольні питання

Чому для екстракції аскорбінової кислоти використовують кислоту?
У кислому середовищі аскорбінова кислота значно стійкіша до окиснення, а аскорбатоксидаза та іони металів менш активні.
Як визначають кінець титрування за Тільмансом?
Доки в розчині є аскорбінова кислота, барвник знебарвлюється; коли вона вичерпується, з'являється рожеве забарвлення (барвник у кислому середовищі), що не зникає протягом 30 с.
Чому руйнування вітаміну С вважають реакцією першого порядку?
Швидкість пропорційна поточній концентрації аскорбінової кислоти: графік ln C від t — пряма, а період напіврозпаду не залежить від початкової концентрації.
Що впливає на швидкість руйнування вітаміну С під час варіння?
Температура й тривалість нагрівання, доступ кисню, pH, присутність іонів міді та заліза, активність аскорбатоксидази, об'єм води (вимивання).
Яка роль аскорбату в рослинній клітині?
Він знешкоджує активні форми кисню (аскорбат-глутатіоновий цикл), регенерує токоферол, є кофактором діоксигеназ і бере участь у ксантофіловому циклі захисту від надлишку світла.

07Література

  1. Smirnoff N. Ascorbic acid metabolism and functions: A comparison of plants and mammals. Free Radical Biology and Medicine. 2018. Vol. 122. P. 116–129.
  2. Santos P. H. S., Silva M. A. Retention of vitamin C in drying processes of fruits and vegetables — a review. Drying Technology. 2008. Vol. 26. P. 1421–1437.
  3. AOAC Official Method 967.21. Ascorbic acid in vitamin preparations and juices: 2,6-dichloroindophenol titrimetric method. In: Official Methods of Analysis of AOAC International. Gaithersburg : AOAC International.
  4. Foyer C. H., Noctor G. Ascorbate and glutathione: the heart of the redox hub. Plant Physiology. 2011. Vol. 155. P. 2–18.
← ЛР 7. Дихальний коефіцієнт Усі роботи →