Хроматографія — Інструментальні методи, Онлайн лабораторія НУБіП

01Принцип методу

Хроматографія — метод розділення сумішей, заснований на різному розподілі компонентів між двома фазами: нерухомою (сорбент у колонці чи на пластинці) та рухомою (елюент — рідина або газ). Метод відкрив у 1903 р. ботанік М. С. Цвєт, розділивши пігменти листка на колонці з крейдою: зони різного кольору дали методу назву («письмо кольором»).

Під час руху елюенту молекула тисячі разів переходить у нерухому фазу й повертається назад. Що довше вона в середньому перебуває в нерухомій фазі, то повільніше рухається її зона. Навіть невелика різниця енергії взаємодії, повторена тисячі разів, розводить речовини на окремі зони, а детектор на виході колонки записує хроматограму — послідовність піків.

K = \frac{C_{НФ}}{C_{РФ}}

Коефіцієнт розподілу: відношення рівноважних концентрацій у нерухомій і рухомій фазах.

k^{'} = \frac{t_{R} - t_{0}}{t_{0}} = K \frac{V_{НФ}}{V_{РФ}}

Коефіцієнт ємності: у скільки разів довше речовина перебуває в НФ, ніж у РФ. t₀ — час виходу неутримуваної речовини.

N = 16 {(\frac{t_{R}}{w})}^{2},

Число теоретичних тарілок і висота, еквівалентна теоретичній тарілці (ВЕТТ): що вужчі піки, то ефективніша колонка.

R_{s} = \frac{2 (t_{R 2} - t_{R 1})}{w_{1} + w_{2}} = \frac{\sqrt{N}}{4} \cdot \frac{α - 1}{α} \cdot \frac{{k^{'}}_{2}}{1 + {k^{'}}_{2}}

Роздільна здатність (рівняння Пурнелла). α = k′₂/k′₁ — селективність. Rs ≥ 1,5 — розділення до базової лінії.

Рівняння Пурнелла підказує три способи покращити розділення: підвищити ефективність N (довша колонка, дрібніші частинки, оптимальна швидкість потоку), селективність α (інша нерухома фаза чи склад елюенту) або утримування k′ (слабший елюент). У планарних методах замість часу використовують фактор рухливості R_f = l_плями / l_фронту = 1/(1 + k′).

02Модель колонки

Оберіть вид хроматографії та суміш, змінюйте склад елюенту, градієнт і параметри колонки — хроматограма перераховується одразу. «Запустити аналіз» показує, як зони рухаються колонкою і як детектор записує піки; повзунок часу дозволяє зупинитися в будь-який момент.

Час

Мертвий час t₀

—

Ефективність N

—

Найменша R_s

—

Останній пік

—

Під збільшувальним склом: молекули біля нерухомої фази

Як працює модель. Кожна зона рухається зі швидкістю u/(1 + k′), де k′ залежить від умов елюювання в тому місці колонки, де зона перебуває зараз: для розподільної хроматографії lg k′ = lg k′_w − S·φ, для адсорбційної — lg k′ = lg k′₀ − n·lg φ, для газової — рівняння Вант-Гоффа, для іонообмінної — заряд амінокислоти при даному pH і конкуренція з Na⁺, для гель-фільтрації — K_d = (1 − r_s/r_p)².

Розмивання зони наростає за рівнянням Ван-Деемтера (σ² = H·L), тож на вигляд піків впливають і швидкість потоку, і розмір частинок, і коефіцієнт дифузії (у білків він у 15–20 разів менший, ніж у малих молекул).

03Рівняння Ван-Деемтера

Ширина піку залежить від трьох незалежних механізмів розмивання зони. Їхній внесок у висоту теоретичної тарілки описує рівняння Ван-Деемтера:

H = A + \frac{B}{u} + C \cdot u

(1)

A = 2λd_p — вихрова дифузія (різна довжина шляхів між зернами); B/u = 2γD_m/u — поздовжня молекулярна дифузія, переважає за повільного потоку; C·u — опір масообміну між фазами, переважає за швидкого потоку. Мінімум кривої — оптимальна швидкість u_опт.

Сорбент і речовина

u_опт

—

H_min

—

H при поточній u

—

N колонки

—

Спробуйте: зменшення d_p з 5 до 1,7 мкм (сучасна УВЕРХ) знижує H майже втричі й зсуває оптимум до більших швидкостей — аналіз стає і швидшим, і ефективнішим. Для білків оптимум лежить при дуже малих швидкостях: ось чому гель-фільтрацію ведуть повільно.

04Планарна й осадова хроматографія

На пластинці чи папері елюент піднімається капілярними силами, і речовини зупиняються там, де їх «застав» фронт розчинника. Мірою утримування служить R_f. В осадовій хроматографії зони не рухаються — вони утворюються в колонці в порядку зростання добутку розчинності.

05Порівняння видів хроматографії

Вид	Механізм	Нерухома / рухома фаза	Порядок виходу	Приклади в біології рослин
Адсорбційна	Конкурентна адсорбція на активних центрах поверхні	SiO₂, Al₂O₃, CaCO₃ / неполярний розчинник + полярна добавка	Неполярні → полярні	Пігменти пластид, ліпіди, ПАВ, контроль пестицидів
Розподільна	Розподіл між двома рідкими фазами (закон Нернста)	C₁₈ / вода–метанол (ОФ); вода в целюлозі / бутанол (НФ)	ОФ: полярні → гідрофобні	Фітогормони, фенольні сполуки, флавоноїди, вітаміни
Газова	Розподіл між газом-носієм і плівкою рідини	Carbowax, полісилоксан / He, N₂, H₂	Леткіші → менш леткі	Жирнокислотний склад олій, ефірні олії, етилен, залишки пестицидів
Іонообмінна	Стехіометричний обмін протиіонів	Катіоніти КУ-2, аніоніти АВ-17, DEAE / буфери з градієнтом pH чи солі	Слабкозаряджені → багатозарядні	Амінокислотний аналіз білків, катіони й аніони ґрунтових витяжок
Ексклюзійна	Ситовий ефект пор гелю, без взаємодії	Sephadex, Superdex, Bio-Gel / водний буфер	Великі → малі	Знесолення й фракціонування білків, молекулярна маса ферментів
Афінна	Біоспецифічне зв'язування «ключ — замок»	Агароза + ліганд (Ni²⁺-NTA, білок A, лектин) / буфери зв'язування й елюції	Баласт одразу, цільова речовина — після буфера елюції	Очищення рекомбінантних білків, антитіл, глікопротеїнів (конканавалін A)
Хіральна	Тимчасові діастереомерні комплекси, трьохточкова взаємодія	Полісахаридні фази, циклодекстрини / гексан–спирт	1–2 контакти → 3 контакти	Енантіомери терпеноїдів (карвон, лімонен), D-/L-амінокислоти, ліки
Осадова	Різна розчинність осадів з реагентом-осаджувачем	Al₂O₃ + AgNO₃ (чи інший осаджувач) / водний розчин	Зверху — найменший ДР, знизу — найбільший	Галогеніди, важкі метали у воді й рослинній сировині

06Контрольні питання

Чому β-каротин на силікагелі виходить першим, а хлорофіл b — пізно?

β-Каротин — неполярний вуглеводень C₄₀H₅₆ без функціональних груп, він майже не утворює водневих зв'язків із групами ≡Si–OH. Хлорофіл b має альдегідну групу та естерні групи порфіринового кільця, тому сильніше адсорбується. У моделі це видно з k′: у каротину він близький до нуля.

Як зміниться час утримування в ОФ-ВЕРХ, якщо збільшити частку метанолу з 40 до 50 %?

За рівнянням lg k′ = lg k′_w − S·φ при S ≈ 4 k′ зменшиться в 10^0,4 ≈ 2,5 раза: усі речовини вийдуть швидше, але піки зблизяться, і роздільна здатність критичної пари може впасти.

Навіщо в газовій хроматографії програмують температуру?

В ізотермічному режимі легкі компоненти виходять тісною групою, а важкі — дуже пізно широкими піками (у моделі ментол і карвон при 70 °C не виходять узагалі). Поступове нагрівання прискорює важкі компоненти, вирівнює ширину піків і скорочує аналіз.

Чому в гель-фільтрації першими виходять найбільші молекули?

Великі молекули не входять у пори гелю (K_d = 0) і проходять лише міжзерновий об'єм V₀. Малим молекулам доступний увесь об'єм пор, їхній шлях найдовший, тому вони виходять останніми при V_t = V₀ + V_p.

Що станеться в афінній хроматографії His-tag білка, якщо в промивному буфері забагато імідазолу?

Імідазол конкурує з гістидиновими залишками за Ni²⁺. За високої концентрації цільовий білок почне елююватися ще під час промивання разом із домішками — його втрати зростуть. Замало імідазолу — і білки-домішки вийдуть разом із цільовим білком у буфері елюції.

Як підвищити роздільну здатність, не змінюючи хімію розділення?

Збільшити N: подовжити колонку (R_s ~ √L), зменшити розмір частинок або наблизити швидкість потоку до оптимуму на кривій Ван-Деемтера. Подвоєння довжини колонки підвищує R_s лише в √2 ≈ 1,4 раза, але вдвічі подовжує аналіз.

Чому енантіомери не розділяються на звичайній колонці C₁₈?

Енантіомери мають однакові фізико-хімічні властивості в ахіральному середовищі, отже однакові k′ (α = 1). Розділення можливе лише з хіральним селектором, з яким один енантіомер утворює три комплементарні контакти, а інший — лише два.

Як за R_f визначити амінокислоту на паперовій хроматограмі?

Виміряти відстань від старту до центру плями та до фронту розчинника, обчислити R_f і порівняти зі стандартами, нанесеними на той самий аркуш (умови мають бути однаковими). Гідрофобні амінокислоти (лейцин, валін) мають великі R_f, полярні й заряджені (лізин, аспарагінова кислота) — малі.

07Література

Мінаєва В. О. Хроматографічний аналіз : підручник. — Черкаси : ЧНУ ім. Б. Хмельницького, 2013. — 284 с.
Юрченко О. Г., Родіонов В. М. Методичні вказівки до вивчення курсу «Хроматографічні методи розділення органічних сполук». — Київ : НТУУ «КПІ», 2008. — 130 с.
Мінаєва В. О. Іонний обмін та іонообмінна хроматографія : практичний посібник. — Черкаси : ЧНУ, 2013. — 128 с.
Гризодуб О. І., Леонтьєв Д. А. Хроматографія ; Іонообмінна хроматографія // Фармацевтична енциклопедія. — Київ, 2016.
Hong P., Koza S., Bouvier E. S. P. Size-exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. — 2012. — Vol. 35. — P. 2923–2950.
Bui C. V., Rosenau T., Hettegger H. Polysaccharide- and β-cyclodextrin-based chiral selectors for enantiomer resolution // Molecules. — 2021. — Vol. 26, № 14. — 4322.
Snyder L. R., Kirkland J. J., Dolan J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. — 3rd ed. — Wiley, 2010.

← Інструментальні методи Онлайн лабораторія →